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家蚕微孢子虫感染对家蚕BmN细胞凋亡以及凋亡蛋白抑制因子IAPs表达的影响
《微生物学报 》 2017 北大核心 CSCD
摘要：【目的】在无任何外界凋亡因素诱导条件下,探究家蚕微孢子虫感染对家蚕卵巢细胞-BmN凋亡的影响,以及凋亡蛋白抑制因子IAPs实相表达的变化情况。【方法】显微镜下观察家蚕微孢子虫感染BmN细胞后不同时间段宿主细胞的变化情况,以及利用荧光定量PCR方法检测家蚕促凋亡基因——细胞色素C(BmCyt c)表达水平的变化,随后检索家蚕基因组与蛋白质家族数据库搜寻家蚕凋亡蛋白抑制因子IAPs基因信息,并通过荧光定量PCR方法对这些基因的实相表达情况进行定量分析。【结果】家蚕微孢子虫感染BmN细胞的前5 d,细胞状态未见明显变化。感染后7 d,BmN细胞的生长受到了一定程度的影响。第12天时,对照组中几乎所有细胞出现空泡化或细胞死亡的现象,而感染家蚕微孢子虫的BmN细胞未见空泡的出现,并且大量细胞形态完整,细胞核清晰可见。同时,BmCyt c基因的表达几乎一直处于被抑制状态,特别是感染后的第10天与第12天,该基因的表达量显著性降低(P<0.01)。通过数据库检索共得到4个家蚕凋亡蛋白抑制因子:BmIAP-1、BmIAP-2、BmSurvivin-1与BmSurvivin-2。荧光定量PCR结果表明:BmIAP-1和BmSurvivin-1基因在感染后期(10 d与12 d)表达量有上升趋势,尤其是感染后的12 d,表达量显著上升(P<0.01)。然而,BmIAP-2与BmSurvivin-2基因的表达在大多数时间段均处于下调状态。【结论】当无任何外界凋亡因素诱导条件下,家蚕微孢子虫感染BmN细胞后可影响宿主细胞的生长,并可抑制细胞的正常生理凋亡。依据荧光定量PCR结果,我们推测在家蚕微孢子虫感染BmN细胞时,BmIAP-1和BmSurvivin-1蛋白可能在调节细胞凋亡的过程中起一定作用。
关键词： 家蚕卵巢细胞 家蚕微孢子虫 细胞凋亡 家蚕凋亡蛋白抑制因子 荧光定量PCR
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蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12基因的克隆分析与原核表达
《中国病原生物学杂志 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：目的克隆并表达蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12。方法根据家蚕微孢子虫基因组数据库信息设计简并引物进行PCR扩增,克隆得到蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12基因。利用生物信息学软件对NpSWP12的基因与蛋白序列进行分析与结构功能预测。将该蛋白基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,转化表达载体至大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE与Western blot检测。结果蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12基因长687bp,编码228个氨基酸残基(基因登录号:KT287071),预测蛋白质分子质量单位为26.6ku,等电点(pI)为5.96。蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12基因结构为单外显子结构,编码的蛋白中α螺旋占77.19%。该编码蛋白含有1个BAR结构域(Bin/Aphiphysin/Rvs domain),属BAR结构域蛋白质超家族成员。NpSWP12与家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbSWP12核苷酸序列序列相似性为95.2%,氨基酸序列相似性为96.9%。表达载体NpSWP12/pET-30a(+)转入BL21(DE3)菌株,IPTG诱导,得到的重组蛋白rNpSWP12与理论蛋白分子质量大小(30ku)相符。Western blot鉴定。结论成功克隆了蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12基因,构建的NpSWP12/pET-30a(+)重组原核表达载体表达预期分子质量的融合蛋白,该蛋白能被相应抗体识别,为进一步研究NpSWP12的细胞定位和功能奠定了基础。
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