基于TaqMan探针实时荧光定量PCR检测兰花环斑病毒方法的建立

孙爱青; 王丽花; 杨秀梅; 许凤; 张艺萍; 苏艳; 《微生物学通报 》 2023 北大核心 CSCD

摘要：【背景】兰花环斑病毒（cymbidium ringspot virus, CymRSV）是一类重要的检疫性病毒，在世界范围内危害严重。【目的】建立一种特异性强、灵敏度高且能定量分析CymRSV携带情况的高效检测方法。【方法】通过比对5个CymRSV CP基因序列，利用高度保守区设计3对引物探针并优化筛选后，获得145 bp的靶标序列及对应的最优引物及探针组合。以该靶标序列为模板构建阳性重组质粒，建立标准曲线，并探究其灵敏度、特异性、稳定性和应用效果。【结果】建立的CymRSV实时荧光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR）检测法对阳性质粒标准品的最低检出限可达1 copy，最低稳定检出限达5 copies/μL，是逆转录-聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）灵敏度的10~3-10~4倍；标准曲线y=-3.332x+40.371显示，Ct值与拷贝数的对数线性关系良好，扩增效率为99.6%，相关系数R2为0.999；与其他5种常见病毒反应均无扩增曲线，检测特异性强；批组内与批组间重复性试验Ct值变异系数均小于0.6%，重复性和稳定性较好。利用该方法对4类不同种属的20个兰花样品进行检测，阳性对照在Ct为23.31出现扩增曲线，阴性对照及样品未出现扩增曲线。【结论】基于Taq Man探针的CymRSV实时荧光定量PCR检测方法的成功创建，可为开展兰花CymRSV病毒的精准检测与科学防控提供技术支撑。

关键词： 兰花环斑病毒 TaqMan探针 实时荧光定量PCR 兰花