桑树几丁质酶基因Machi1的克隆及原核表达

肖圣燕; 朱峰; 冉瑞法; 李镇刚; 张永红; 邵榆岚; 唐芬芬; 白兴荣; 《蚕业科学 》 2019 北大核心 CSCD

摘要：以桑品种云桑2号的健康叶片为材料,通过反转录PCR结合RACE方法克隆到桑树几丁质酶基因Machi1(GenBank登录号:MK783295).Machi1基因的完整ORF序列长度为972 bp,编码323个氨基酸残基,预测Machi1蛋白分子质量为349kD,理论等电点(pI)为684.结构分析显示Machi1蛋白含有一个信号肽,无跨膜结构域.Machi1蛋白属于糖苷水解酶19家族,含有保守的ChtBD1结构域,预测具有几丁质酶活性.多序列比对结果表明,Machi1蛋白与川桑几丁质酶Mnchi19一致性最高为935%,系统进化树结果与之相一致.组织表达模式分析结果表明,Machi1基因在桑树叶片中的表达量最高.随后通过原核表达系统获得了重组目的蛋白并进行了纯化,用纯化的蛋白质免疫新西兰大白兔制备Anti-Machi1多克隆抗体.利用间接ELISA法测定其效价在1∶80 000以上,并经Western blotting验证了该多克隆抗体的特异性,为后续研究Machi1的抗病机制及生物学功能奠定了基础.

关键词： 桑树 几丁质酶 基因克隆 原核表达 多克隆抗体

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