基于Ypt1靶标的非洲菊隐地疫霉TaqMan探针实时荧光定量PCR检测

王丽花; 孙爱青; 张艺萍; 许凤; 杨秀梅; 《微生物学通报 》 2024 北大核心 CSCD

摘要：【背景】隐地疫霉(Phytophthora cryptogea P.)是一种可危害多种植物且危害症状较为严重的检疫性病原卵菌，在世界范围内危害严重。【目的】建立一种特异性强、灵敏度高且能定量分析P. cryptogea携带情况的高效检测方法。【方法】根据隐地疫霉Ypt1基因的保守序列设计并筛选实时荧光定量PCR的特异性引物和探针，在优化引物浓度、探针浓度和退火温度的基础上获得最优反应体系和条件，利用最优反应条件构建标准曲线及检测体系，并验证检测体系的特异性、灵敏性和重复性。【结果】综合考虑Cq值、最终荧光信号值(relative fluorescence units,RFU)和经济角度，优化后的隐地疫霉荧光定量PCR最佳退火温度为60℃，上、下游引物浓度均为20μmol/L，探针浓度为10μmol/L；所建立的标准曲线为y=-3.323x+40.767，相关系数(R2)为0.998，扩增效率(E)为99.9%，相关性好、扩增效率高；对其他8种常见卵菌及真菌均无扩增曲线，表明所设计的引物探针组合特异性强；灵敏度检测结果显示最低检出限为1 copy，最低稳定检出限为10 copies，较常规PCR技术的灵敏度提高了10-100倍；同浓度批组内和批组间重复性试验Cq值标准差为0.04-0.13，变异系数(coefficient of variation, CV)为0.20%-0.58%，重复性及稳定性好、可靠性高。【结论】基于Ypt1靶标建立了非洲菊隐地疫霉TaqMan实时荧光定量PCR检测技术体系，可高效特异地鉴别出疫霉属中广泛侵染非洲菊的隐地疫霉病菌，对于口岸通关和田间隐地疫霉的快速高效检测，尤其是原原种、原种等核心材料的痕量病原菌的检测鉴定和病害早期精准诊断，以及有效防控意义重大，应用前景广阔。

关键词： 非洲菊 隐地疫霉 Ypt1基因 实时荧光定量PCR TaqMan探针