文献类型： 中文期刊

作者： 王丽花 ¹ ; 孙爱青 ¹ ; 张艺萍 ¹ ; 许凤 ¹ ; 杨秀梅 ¹ ;

作者机构： 1.云南省农业科学院花卉研究所云南省花卉育种重点实验室国家观赏园艺工程技术研究中心

关键词： 非洲菊;隐地疫霉;Ypt1基因;实时荧光定量PCR;TaqMan探针

期刊名称： 微生物学通报

ISSN： 0253-2654

年卷期： 2024 年 51 卷 009 期

页码： 3658-3672

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【背景】隐地疫霉(Phytophthora cryptogea P.)是一种可危害多种植物且危害症状较为严重的检疫性病原卵菌，在世界范围内危害严重。【目的】建立一种特异性强、灵敏度高且能定量分析P. cryptogea携带情况的高效检测方法。【方法】根据隐地疫霉Ypt1基因的保守序列设计并筛选实时荧光定量PCR的特异性引物和探针，在优化引物浓度、探针浓度和退火温度的基础上获得最优反应体系和条件，利用最优反应条件构建标准曲线及检测体系，并验证检测体系的特异性、灵敏性和重复性。【结果】综合考虑Cq值、最终荧光信号值(relative fluorescence units,RFU)和经济角度，优化后的隐地疫霉荧光定量PCR最佳退火温度为60℃，上、下游引物浓度均为20μmol/L，探针浓度为10μmol/L；所建立的标准曲线为y=-3.323x+40.767，相关系数(R2)为0.998，扩增效率(E)为99.9%，相关性好、扩增效率高；对其他8种常见卵菌及真菌均无扩增曲线，表明所设计的引物探针组合特异性强；灵敏度检测结果显示最低检出限为1 copy，最低稳定检出限为10 copies，较常规PCR技术的灵敏度提高了10-100倍；同浓度批组内和批组间重复性试验Cq值标准差为0.04-0.13，变异系数(coefficient of variation, CV)为0.20%-0.58%，重复性及稳定性好、可靠性高。【结论】基于Ypt1靶标建立了非洲菊隐地疫霉TaqMan实时荧光定量PCR检测技术体系，可高效特异地鉴别出疫霉属中广泛侵染非洲菊的隐地疫霉病菌，对于口岸通关和田间隐地疫霉的快速高效检测，尤其是原原种、原种等核心材料的痕量病原菌的检测鉴定和病害早期精准诊断，以及有效防控意义重大，应用前景广阔。