科研产出
大麻叶片基因组DNA快速提取方法与应用
《江西农业学报 》 2023
摘要：为满足大麻植物分子检测鉴定与大批量育种材料的分子标记辅助筛选、基因克隆、测序等需要,以改良的CTAB法为对照,通过对碱裂解法、TPS缓冲液法、TE缓冲液法等快速提取方法进行对比与优化,对可能影响DNA提取产量及质量的影响因素进行了分析,确定了提取液的组成及用量、样本量与采集方法、提取过程中各步骤操作与所需时间、保存时间及应用范围等技术参数,建立了一套微量、高效、快速的大麻叶片基因组DNA提取方法,即利用简易打孔器取2个直径为0.5 cm的叶片放入2 mL 的离心管中,加入300 μL的TE提取液(10 mmol/L EDTA,150~200 mmol/L Tris-HCl)及2粒钢珠,快速震荡30 s,震荡后的样品在13000 r/min下离心1 min,取100~150 μL上清液于-18℃冷冻15 min,室温溶解后13000 r/min下离心1 min,可用于PCR扩增.该方法样品用量小、操作简单经济、用时短、效率高、易于大批量操作提取,使用安全,PCR扩增效果佳,可广泛应用于大麻分子鉴别与育种材料的分子标记辅助选择等.
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排连珠状蚕粪症状蚕病的鉴定研究 -以云南省祥云县蚕区为例
《广西蚕业 》 2021
摘要：2019年云南祥云县蚕区正秋蚕大规模发生排连珠状蚕粪症状的蚕病,部分蚕户因蚕病暴发颗粒无收,损失惨重.为诊断该蚕病,以进行针对防控,避免损失的再次发生,课题组通过肉眼观察病蚕病症及了解饲养环境,结合对蚕户养蚕过程中蚕病防控等重点环节和关键技术处理情况的了解,初步推测该蚕病为浓核病.设计特异性引物,以病蚕基因组为模板进行PCR扩增来检测该蚕区的病蚕是否感染BmDNV.通过PCR检测结果得知,其中2份样品感染了BmDNV,通过对4龄起蚕和5龄起蚕添食BmDNV病毒进一步确诊,观察感染病毒后蚕发病病征与祥云蚕区病蚕病征大概一致,尤其排连珠状粪便病征明显.经过PCR分子检测方法和感染试验可确定该蚕病属病毒病浓核病,为祥云县蚕区下一步的蚕病防控提供依据.
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花青素合成相关基因在二倍体彩色马铃薯薯肉中的表达分析
《分子植物育种 》 2021 北大核心 CSCD
摘要：为了探究彩色马铃薯薯肉颜色分布的机理,本试验利用RT-PCR技术,检测了与花青素合成相关的6种结构基因和4种调节基因,在彩色马铃薯杂交组合后代中不同薯肉颜色个体以及同一薯块中不同薯肉颜色部分的表达情况,研究这些结构基因和调节基因在薯肉中的表达模式。结果显示,在75个杂交后代中,除结构基因DFR外,其余5个结构基因在红色和紫色薯肉中都有较高的表达量,而在81%（StCHS）～93%（StF3H）黄色或白色薯肉中表达量比较低甚至不表达;4个调节基因在90%（StAN2）～100%（StMBA113）黄色或白色薯肉以及所有紫色（除G17-23-36外）和红色薯肉中都有表达。本研究结果表明,来自同一父母本的后代薯肉颜色的差异可能是由结构基因表达量的差异或者在花青素合成通路存在结构基因没有表达而导致,而且4个调节基因可能并不是限制花青素合成的关键转录因子。
关键词： 彩色马铃薯（Solanum tuberosum L.） 花青素合成 RT-PCR 表达分析
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农杆菌介导遗传转化云蔗05-51
《云南农业大学学报(自然科学版) 》 2021 北大核心 CSCD
摘要：【目的】建立云蔗05-51组培再生体系明确其对抗生素G418的耐受性,为云蔗05-51基因工程遗传改良提供参考。【方法】以云蔗05-51心叶为外植体,MS基本培养基添加2, 4-D、6-BA和KT,设置质量浓度梯度及不同激素配比,诱导愈伤组织及其分化植株。在云蔗05-51胚性愈伤组织增殖与不定芽分化阶段,培养基中添加不同含量的G418,确定合适的G418筛选质量浓度。以nptⅡ为标记基因,农杆菌介导遗传转化云蔗05-51胚性愈伤组织,筛选获得抗性植株,PCR和NPTⅡImmunoStrip检测确定nptⅡ基因的整合与表达。【结果】云蔗05-51愈伤组织诱导与增殖阶段,适宜的培养基配方为MS基本培养基添加3.0 mg/L 2, 4-D;愈伤组织分化不定芽阶段宜采用MS基本培养基添加1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT。云蔗05-51对G418耐受性筛选结果显示:愈伤组织增殖阶段和分化不定芽阶段G418的适宜筛选质量浓度分别为40和20 mg/L。G418抗性植株PCR检验表明:标记基因nptⅡ已成功整合到云蔗05-51转基因植株基因组中;NPTⅡImmunoStrip检测表明:nptⅡ的蛋白水平得以表达。【结论】建立了云蔗05-51心叶组培再生体系,明确了40和20 mg/L G418是筛选抗性愈伤和抗性植株的适宜质量浓度。建立了农杆菌介导遗传转化云蔗05-51胚性愈伤组织系统,为有益基因导入甘蔗品种提供了参考。
关键词： 甘蔗 组织培养 G418 nptⅡ PCR NPTⅡImmunoStrip
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黑籽南瓜NBS类抗病基因的鉴别及关键基因分析
《植物生理学报 》 2020 北大核心 CSCD
摘要：以云南栽培的枯萎病抗病品种绿皮黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia)为材料,采用二代转录组和全长转录组测序相结合的方法,对黑籽南瓜NBS类抗病基因进行鉴别和筛选.结果显示:以NB-ARC作为参考氨基酸序列,共鉴定了43条CfNBS (NBS-type gene from C. ficifolia)类基因全长序列,分属于TNL、CNL、TN、RPW8-N和N类5个亚基因家族,典型的TNL和CNL类分别有2个和13个.系统进化树分析表明, CfNBS类基因可以分为4大类群,黑籽南瓜的NBS类抗病基因数量较少但其基因进化类型比其他瓜类物种丰富.与二代转录组进行比对,筛选获得11个差异表达的黑籽南瓜NBS类关键基因,包括4个抗病蛋白、2个蛋白激酶、2个TMV抗性蛋白和3个未知功能蛋白, qRT-PCR分析表明有10个Cf NBS类关键基因在枯萎病菌接种后48和96 h出现上调或下调表达,可能参与了黑籽南瓜对枯萎病菌侵染不同时间点的抗病应答过程.11个CfNBS类关键基因的GO (Gene Ontology)功能富集分析表明,其涉及的生物学过程显著富集在防卫反应、谷胱甘肽转运、改良氨基酸转运等10条GO条目中,涉及分子功能富集在ADP结合、受体丝氨酸/苏氨酸激酶结合、细胞壁结构成分3个GO条目中.而富集通路最多的是与TMV抗性蛋白同源的2个基因(CL19588contig1和CL21402contig1),说明这2个基因在抗病应答过程中起到了重要作用.11个CfNBS类关键基因qRT-PCR组织表达特异性分析表明,在根、茎、叶和果实中表达量最高的基因分别是CL34065Contig1、CL52011Contig1、CL6035Contig1和CL19588Contig1.以上结果可为开展黑籽南瓜NBS类抗病基因的克隆和功能验证,以及解析黑籽南瓜响应枯萎病菌胁迫的抗性应答机制提供参考.
关键词： 黑籽南瓜 枯萎病 转录组 NBS类基因 qRT-PCR
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枯萎病菌胁迫下3种黑籽南瓜HQRGA2表达及抗氧化酶活性差异分析
《植物生理学报 》 2019 北大核心 CSCD
摘要：以云南栽培的3个黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia)品种(白皮、花皮和绿皮品种)为试材,在室内接种评价枯萎病抗性基础上,研究了3种材料受枯萎病菌胁迫后NBS抗病基因同源序列HQRGA2(GenBank登录号MG946756)的表达差异,以及活性氧产生和抗氧化酶活性差异。结果显示,3种黑籽南瓜HQRGA2的表达均受枯萎病菌诱导,与感病白皮品种和中抗花皮品种相比,抗病绿皮品种HQRGA2的表达水平增加迅速且持续能力强,呈增加-降低的表达特点。接种枯萎病菌后,感病品种和中抗品种■产生速率呈上升趋势,抗病品种则在侵染中后期急剧升高。感病品种和中抗品种的POD活性、MDA含量主要呈升-降-升的变化趋势,SOD活性则主要呈先升后降的变化趋势;而抗病品种的POD和SOD活性变化平稳,MDA含量呈逐步增加的趋势。枯萎病抗性与侵染早期POD和SOD活性呈负相关,与后期MDA含量呈正相关,而CAT活性与抗性并无一致性,感病品种和抗病品种的变化平稳,中抗品种表现为平稳-升高。由此表明,枯萎病菌侵染黑籽南瓜后,产生了较高水平的■,感病品种主要依赖SOD和POD,中抗品种依赖POD、SOD和CAT来清除活性氧,以增加植株的抗氧化能力。与感病品种相比,抗病品种能迅速启动并维持NBS类抗病基因序列的高量表达,其抗氧化酶可维持较高的活性水平,但对枯萎病菌胁迫不敏感。
关键词： 黑籽南瓜 枯萎病 NBS类基因 qRT-PCR 抗氧化酶
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云南泸西苹果病虫害调查与病原及害虫鉴定
《南方园艺 》 2019
摘要：云南红河州泸西县为云南重要的苹果新产区,调查鉴定泸西县苹果病虫害的发生情况,对泸西县的苹果病虫害防控,苹果产业发展具有重要意义。本研究系统调查和鉴定了云南红河州泸西县向阳乡习峨村、三塘乡、向阳乡沙马村等3个苹果产区的病虫害。通过室内病原显微观察,对真菌病原进行形态鉴定,应用RT-PCR检测技术与测序鉴定病毒,害虫形态鉴定。最终结果表明:云南泸西苹果病虫害共8种,其中真菌病害3种,有斑点落叶病、枝干轮纹病、褐斑病;病毒病害2种,有苹果茎沟病毒病、苹果花叶病毒病;虫害3种,蚜虫、蓟马和金纹细蛾3种虫害。其中斑点落叶病和褐斑病为主要病害,病毒病害其次,虫害发生率较小。其次通过调查与鉴定,否定了危险性病害苹果炭疽叶枯病在云南泸西的存在。
关键词： 泸西 苹果 病虫害 RT-PCR 检测 炭疽叶枯病
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款冬转录组SSR标记开发及其多态性研究
《中草药 》 2019 北大核心 CSCD
摘要：目的分析款冬转录组数据的简单重复序列标记(SSR)位点信息并设计特异引物,以期为款冬分子标记辅助育种提供有力工具.方法对款冬转录组测序数据库中长度1 kb以上的18 938条unigene,利用MISA软件搜索SSR位点信息,利用Primer3设计引物,并随机选择55对SSR引物分析18份不同来源款冬材料的多态性.结果共搜索到4688个SSR位点,分布于3844条unigene中,SSR出现频率为24.75%,平均7979bp含1个SSR位点.SSR位点中三核苷酸重复类型出现频率最高(37.12%),其次是单核苷酸重复(32.36%)和二核苷酸重复(28.20%).共有60种重复基元,其中A/T(31.42%)、AG/CT(12.80%)、ATC/ATG(9.62%)是优势重复基元.随机选择55对引物进行多态性验证分析,其中42对有扩增产物,14对具稳定可重复的多态性;利用UPGMA作图,将18份样品分为3类.结论款冬转录组中SSR位点出现频率高,类型丰富,多态性高,为其遗传多样性分析、遗传图谱构建和分子标记辅助育种等研究提供了候选分子标记.
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黑籽南瓜中NBS类抗病基因同源序列的克隆与表达分析
《农业生物技术学报 》 2018 北大核心 CSCD
摘要：黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia)是云南特有的对病害有较强抗性的一种瓜类作物。为发掘利用其蕴含的优异抗病基因资源,本研究根据已克隆到的植物核苷酸结合位点(nucleotide binding site,NBS)类抗病基因的保守氨基酸结构域基因设计简并引物,通过PCR扩增从黑籽南瓜基因组中分离了8条黑籽南瓜抗病基因同源序列(resistance gene analogous,RGAs),聚类分析和相似性比较结果显示,黑籽南瓜抗病基因同源序列2(black seed squash resistance gene analogous 2,HQRGA2(Gen Bank No.:MG946756)单独为一类,且具有核苷酸结合衔接子(nucleotide-binding adaptor shared by APAF-1,R proteins and CED-4;NBARC)结构,其余7条序列均不具有NBS保守结构域。核苷酸相似性分析表明,HQRGA2与部分抗病基因序列的相似性达到87%~99%,其中与南瓜(Cucurbita maschata)NBS类抗病蛋白基因13(squash resistance gene analogous,SQRGA-13)和SQRGA-8的相似性分别达到98.0%和97.0%。对HQRGA2编码的氨基酸保守结构域分析表明,其含有NBS类抗病基因的4个保守模块:P-loop、Kinase-2、Kinase-3a和GLPL区,且属于无Toll蛋白或白介素1受体类似的NBS富亮氨酸重复(non toll/interleukin-1 receptor like of NBS plus leucine-rich region,non-TIR-NBS-LRR)类抗病基因同源序列。HQRGA2编码氨基酸的同源性分析结果表明,其与南瓜抗病蛋白基因SQRGA-13氨基酸同源性较高,达到96.6%,与其余抗病基因同源性在16.6%~43.8%之间,NBS区域氨基酸系统进化树分析结果表明,HQRGA2可能是一个新的抗病基因片段。q RTPCR分析表明,黑籽南瓜HQRGA2片段的表达受尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的胁迫诱导,表现出先扬后抑的表达模式,说明HQRGA2可能为抗病相关基因片段。黑籽南瓜中NBS类抗病基因同源序列HQRGA2的获得为分离克隆其完整抗病基因提供了新线索。
关键词： 黑籽南瓜 核苷酸结合位点(NBS)类基因 保守结构域 qRT-PCR
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