文献类型： 中文期刊

作者： 张晓东 ¹ ; 李彩霞 ² ; 李爽 ² ; 刘倩倩 ² ; 王元忠 ² ; 王家金 ³ ;

作者机构： 1.玉溪师范学院资源环境学院;云南省农业科学院药用植物研究所

2.;玉溪师范学院资源环境学院;云南省农业科学院药用植物研究所

3.;玉溪师范学院资源环境学院;云南省农业科学院药用植物研究所;

关键词： 滇龙胆;香叶醇10-羟化酶;基因克隆;表达分析

期刊名称： 西南农业学报

ISSN： 1001-4829

年卷期： 2017 年 07 期

页码： 1499-1506

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】克隆滇龙胆香叶醇10-羟化酶基因Gr G10H(geraniol 10-hydroxylase),分析其生物信息学特征、基因结构、蛋白表达和组织表达情况,为龙胆苦苷生物合成途径解析提供理论依据。【方法】通过RT-PCR及基因克隆方法,从滇龙胆总RNA中克隆得到基因Gr G10H及其基因组序列;使用生物信息学方法分析其DNA序列及其编码蛋白特性,使用Clustal X2.1软件对Gr G10H蛋白质及其同源序列做序列比对,使用MEGA7.0软件进行系统发育树构建;利用定量PCR技术分析Gr G10H基因在滇龙胆根茎叶中的表达水平。【结果】使用RT-PCR方法从滇龙胆叶片中克隆得Gr G10H基因全长为1834 bp,包含2外显子和1内含子,ORF1548 bp,将序列提交至Gen Bank,得到序列号KJ418410。生物信息学分析表明,该基因编码515个氨基酸,分子量为57.74 k D,理论等电点为9.02;该蛋白属于细胞色素P450超家族成员,定位于内质网,其N端含一跨膜螺旋(21~43),其中1~20氨基酸残基位于膜内,44~515位于膜外。该蛋白无信号肽,为亲水稳定蛋白,主要由无规则卷曲(44.85%)和α-螺旋(40.58%)构成。Gr G10H蛋白与川西獐牙菜Sm G10H蛋白具有较高的相似性(87%),且亲缘关系最近。原核表达结果表明,Gr G10H基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为83.74 k D(含GST标签26.00 k D),与预期蛋白大小一致。组织特异性表达分析结果表明Gr G10H基因主要在叶中表达。【结论】克隆到滇龙胆Gr G10H基因,并成功在大肠杆菌中表达,推测其在主要叶片中起作用。