科研产出
云南蚕区家蚕微孢子虫遗传多样性分析
《生物技术进展 》 2024
摘要：家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）是蚕业生产上一种重要病害——微粒子病的病原体。探讨家蚕微孢子虫种内的遗传多样性，可为云南蚕区家蚕微粒子病的防控提供参考依据。从云南省不同养蚕地区收集了感染微孢子虫的病蚕样品，分离纯化家蚕微孢子虫并提取基因组，克隆SSU rDNA(small subunit ribosomal DNA)和ITS(internal transcribed spacer)序列并进行生物信息学分析。结果发现，云南蚕区Nosema bombycis分离株SSU rDNA序列同源性高达99%以上，遗传距离小于0.006，它们在长度和多个位点存在差异，呈现不同程度的多态性；ITS遗传差异较为显著，序列中存在多碱基的插入或缺失、单碱基的转换和颠换。基于SSU rDNA和rDNA-ITS序列构建系统发生树，结果显示，云南蚕区家蚕微孢子虫分离株系间存在遗传分化，种群间亲缘关系与地理位置无直接联系。研究结果丰富了云南蚕区家蚕微孢子虫的种内遗传多样性。
关键词： 家蚕微孢子虫 遗传多样性 核糖体小亚基 转录间隔区
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家蚕微孢子虫感染对家蚕海龟蛋白(Bmtutl)基因表达水平的影响
《昆虫学报 》 2019 北大核心 CSCD
摘要：[目的]本研究旨在阐明家蚕微孢子虫Nosema bombycis感染不同时间对家蚕Bombyx mori幼虫不同组织中家蚕海龟蛋白(Bombyx Turtle, Bmtutl)基因表达水平的影响,为揭示家蚕微孢子虫的侵染机制奠定基础.[方法]利用生物信息学方法对家蚕海龟蛋白3种亚型Bmtutl-464, Bmtutl-519和Bmtutl-810的序列结构特征进行了分析;利用qPCR检测家蚕微孢子虫感染后12, 24, 48, 72, 96和120 h,家蚕幼虫中肠、血淋巴与脂肪体组织中Bmtutl-464,Bmtutl-519和Bmtutl-810基因表达水平的变化情况.[结果]家蚕海龟蛋白3种亚型的二级结构均主要由无规则卷曲、α螺旋、β转角和延伸链组成,其中无规则卷曲所占比例最高.但是PredictProtein分析发现,Bmtutl-464, Bmtutl-519和Bmtutl-810之间的蛋白/多核苷酸结合位点存在较大差异.qPCR结果表明,感染家蚕微孢子虫后,家蚕幼虫中肠、血淋巴与脂肪体组织中Bmtutl-464,Bmtutl-519和Bmtutl-810基因的整体表达处于被抑制状态,尤其在脂肪体中最为明显:Bmtutl-519和Bmtutl-810基因的表达在家蚕微孢子虫感染家蚕后的72 h开始受到显著抑制,特别是Bmtutl-519基因,其相对表达水平均不到对照的5.0%.[结论]家蚕海龟蛋白这3种亚型的序列结构特征存在较大差异,家蚕微孢子虫感染在一定程度抑制了家蚕幼虫中肠、血淋巴与脂肪体组织中Bmtutl-464,Bmtutl-519和Bmtutl-810基因尤其是Bmtutl-519的表达.结果说明,与其他两种家蚕海龟蛋白亚型相比,Bmtutl-519蛋白可能在家蚕微孢子虫侵染宿主的过程中起主要作用.
关键词： 家蚕 家蚕微孢子虫 家蚕海龟蛋白 序列分析 时相表达
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家蚕微孢子虫感染对家蚕BmN细胞凋亡以及凋亡蛋白抑制因子IAPs表达的影响
《微生物学报 》 2017 北大核心 CSCD
摘要：【目的】在无任何外界凋亡因素诱导条件下,探究家蚕微孢子虫感染对家蚕卵巢细胞-BmN凋亡的影响,以及凋亡蛋白抑制因子IAPs实相表达的变化情况。【方法】显微镜下观察家蚕微孢子虫感染BmN细胞后不同时间段宿主细胞的变化情况,以及利用荧光定量PCR方法检测家蚕促凋亡基因——细胞色素C(BmCyt c)表达水平的变化,随后检索家蚕基因组与蛋白质家族数据库搜寻家蚕凋亡蛋白抑制因子IAPs基因信息,并通过荧光定量PCR方法对这些基因的实相表达情况进行定量分析。【结果】家蚕微孢子虫感染BmN细胞的前5 d,细胞状态未见明显变化。感染后7 d,BmN细胞的生长受到了一定程度的影响。第12天时,对照组中几乎所有细胞出现空泡化或细胞死亡的现象,而感染家蚕微孢子虫的BmN细胞未见空泡的出现,并且大量细胞形态完整,细胞核清晰可见。同时,BmCyt c基因的表达几乎一直处于被抑制状态,特别是感染后的第10天与第12天,该基因的表达量显著性降低(P<0.01)。通过数据库检索共得到4个家蚕凋亡蛋白抑制因子:BmIAP-1、BmIAP-2、BmSurvivin-1与BmSurvivin-2。荧光定量PCR结果表明:BmIAP-1和BmSurvivin-1基因在感染后期(10 d与12 d)表达量有上升趋势,尤其是感染后的12 d,表达量显著上升(P<0.01)。然而,BmIAP-2与BmSurvivin-2基因的表达在大多数时间段均处于下调状态。【结论】当无任何外界凋亡因素诱导条件下,家蚕微孢子虫感染BmN细胞后可影响宿主细胞的生长,并可抑制细胞的正常生理凋亡。依据荧光定量PCR结果,我们推测在家蚕微孢子虫感染BmN细胞时,BmIAP-1和BmSurvivin-1蛋白可能在调节细胞凋亡的过程中起一定作用。
关键词： 家蚕卵巢细胞 家蚕微孢子虫 细胞凋亡 家蚕凋亡蛋白抑制因子 荧光定量PCR
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家蚕微孢子虫海藻糖合成酶基因Nbtps1的克隆与原核表达
《蚕业科学 》 2017 北大核心 CSCD
摘要：海藻糖在保护细胞质膜和生物大分子空间结构,维持胞内渗透压增大的过程中发挥重要作用,海藻糖合成酶是海藻糖合成途径中的一个关键酶。通过检索微孢子虫基因组数据库发现,家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)基因组中含有4个海藻糖合成酶基因,其中Nbtps1基因的开放阅读框长1 386 bp,为单外显子结构,编码461个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量53.7 k D,等电点5.19。Nb TPS1蛋白序列含有1个糖基转移酶结构域和4个潜在的N-糖基化位点,亚细胞定位预测该蛋白质位于细胞质中。多重序列比对分析结果表明,Nb TPS1与东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)、兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)海藻糖合成酶的氨基酸序列相似度分别为59.0%、54.7%,系统发育进化树显示三者的亲缘关系与之相符。构建重组表达载体Nbtps1/p ET-28a(+)并转化大肠埃希菌Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导表达及亲和纯化后获得最终质量浓度为1.18 mg/m L的重组融合蛋白His-Nb TPS1。用纯化后的融合蛋白制备兔多克隆抗体Anti-Nb TPS1,利用间接ELISA法测定多克隆抗体的效价达1∶25 600,并通过Western blotting检测验证了该多克隆抗体的特异性,为研究Nb TPS1的生物学功能以及家蚕微孢子虫的间接免疫检测奠定了实验基础。
关键词： 家蚕微孢子虫 海藻糖合成酶 基因克隆 序列分析 原核表达 多克隆抗体
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家蚕微孢子虫SWP25基因BmN细胞表达质粒的构建及表达
《江苏农业学报 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：本研究旨在构建含家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25的家蚕卵巢细胞(BmN)表达质粒,检测该基因在宿主细胞中的表达,为在细胞水平筛选与家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25相互作用的宿主蛋白奠定基础。利用家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac表达系统,将家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25和报告基因EGFP克隆到杆状病毒转移载体pFast Bac1中,转化BmDH10Bac感受态细胞并筛选阳性重组质粒用于转染BmN细胞。经PCR技术鉴定,成功获得重组杆状病毒质粒v BmEGFP-SWP25。在转染成功的细胞中可观测到绿色荧光信号。使用Western blot方法在感染重组病毒的家蚕BmN细胞中检测到大小约55 000的重组蛋白条带,与理论值一致,表明家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25在BmN中成功表达。
关键词： 家蚕微孢子虫 孢壁蛋白SWP25基因 Bac-to-Bac表达系统 重组质粒 转染 融合蛋白表达
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母蛾经高温干燥处理不同时间对体内家蚕微孢子虫的灭活效果
《蚕业科学 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：母蛾抽样检查是家蚕微粒子病检疫工作的重要组成部分。为了明确母蛾检疫前高温干燥灭活可能存在的家蚕微孢子虫的有效处理时间,以被家蚕微孢子虫感染的母蛾为材料,在高温(71℃)条件下分别处理1、2、3、4、5和6 h后,分离母蛾体内的家蚕微孢子虫进行添毒试验,检查其灭活情况。结果表明,高温处理3 h以上的母蛾体内分离的家蚕微孢子虫给3龄、4龄健康起蚕添食后,蚕体未出现感染症状,证明添食的微孢子虫已经失去致病活性。据此建议在蚕种生产的母蛾检疫过程中,须在71℃高温条件下对母蛾处理3 h以上,以避免因抽样母蛾体内的微孢子虫扩散造成的二次环境污染。
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