科研产出
TaqMan探针双重实时荧光定量PCR法同步检测兰花中的建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒
《植物保护 》 2024 北大核心 CSCD
摘要：为建立一种同步定量检测建兰花叶病毒(cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(odontoglossum ringspot virus,ORSV)的高效检测方法,本研究根据CymMV和ORSV CP基因高度保守区分别设计引物和探针并筛选,获得156 bp和148 bp的靶标序列及对应的最优特异性引物探针组合,建立了基于TaqMan探针的双重实时荧光定量PCR方法.该方法最低检出限为1拷贝或6.2×10-3fg,最低稳定检出限为10拷贝或6.2×10-2 fg,是RT-PCR的10~100倍;构建的标准曲线线性关系良好,扩增效率分别为97.7%和100.2%,相关系数R2 分别为1.000和0.999;对其他5种常见病毒均无扩增曲线,检测特异性强;批组内与批组间重复性试验Ct值变异系数≤0.60%,重复性和稳定性好.利用该方法和基因芯片法分别对4个种属的66个兰花样品进行方法验证,该方法相较于基因芯片法检出率提高了 53.85%(CymMV)和162.5%(ORSV).综上所述,本方法可同时高通量检测CymMV和ORSV 2种病毒靶基因,结果可靠,应用前景广阔,可为开展病毒精准鉴定、科学防控以及从源头遏制病毒传播提供技术支撑.
关键词： 建兰花叶病毒 齿兰环斑病毒 TaqMan探针 RT-qPCR 兰花
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基于Ypt1靶标的非洲菊隐地疫霉TaqMan探针实时荧光定量PCR检测
《微生物学通报 》 2024 北大核心 CSCD
摘要：【背景】隐地疫霉(Phytophthora cryptogea P.)是一种可危害多种植物且危害症状较为严重的检疫性病原卵菌，在世界范围内危害严重。【目的】建立一种特异性强、灵敏度高且能定量分析P. cryptogea携带情况的高效检测方法。【方法】根据隐地疫霉Ypt1基因的保守序列设计并筛选实时荧光定量PCR的特异性引物和探针，在优化引物浓度、探针浓度和退火温度的基础上获得最优反应体系和条件，利用最优反应条件构建标准曲线及检测体系，并验证检测体系的特异性、灵敏性和重复性。【结果】综合考虑Cq值、最终荧光信号值(relative fluorescence units,RFU)和经济角度，优化后的隐地疫霉荧光定量PCR最佳退火温度为60℃，上、下游引物浓度均为20μmol/L，探针浓度为10μmol/L；所建立的标准曲线为y=-3.323x+40.767，相关系数(R2)为0.998，扩增效率(E)为99.9%，相关性好、扩增效率高；对其他8种常见卵菌及真菌均无扩增曲线，表明所设计的引物探针组合特异性强；灵敏度检测结果显示最低检出限为1 copy，最低稳定检出限为10 copies，较常规PCR技术的灵敏度提高了10-100倍；同浓度批组内和批组间重复性试验Cq值标准差为0.04-0.13，变异系数(coefficient of variation, CV)为0.20%-0.58%，重复性及稳定性好、可靠性高。【结论】基于Ypt1靶标建立了非洲菊隐地疫霉TaqMan实时荧光定量PCR检测技术体系，可高效特异地鉴别出疫霉属中广泛侵染非洲菊的隐地疫霉病菌，对于口岸通关和田间隐地疫霉的快速高效检测，尤其是原原种、原种等核心材料的痕量病原菌的检测鉴定和病害早期精准诊断，以及有效防控意义重大，应用前景广阔。
关键词： 非洲菊 隐地疫霉 Ypt1基因 实时荧光定量PCR TaqMan探针
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基于TaqMan探针实时荧光定量PCR检测兰花环斑病毒方法的建立
《微生物学通报 》 2023 北大核心 CSCD
摘要：【背景】兰花环斑病毒（cymbidium ringspot virus, CymRSV）是一类重要的检疫性病毒，在世界范围内危害严重。【目的】建立一种特异性强、灵敏度高且能定量分析CymRSV携带情况的高效检测方法。【方法】通过比对5个CymRSV CP基因序列，利用高度保守区设计3对引物探针并优化筛选后，获得145 bp的靶标序列及对应的最优引物及探针组合。以该靶标序列为模板构建阳性重组质粒，建立标准曲线，并探究其灵敏度、特异性、稳定性和应用效果。【结果】建立的CymRSV实时荧光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR）检测法对阳性质粒标准品的最低检出限可达1 copy，最低稳定检出限达5 copies/μL，是逆转录-聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）灵敏度的10~3-10~4倍；标准曲线y=-3.332x+40.371显示，Ct值与拷贝数的对数线性关系良好，扩增效率为99.6%，相关系数R2为0.999；与其他5种常见病毒反应均无扩增曲线，检测特异性强；批组内与批组间重复性试验Ct值变异系数均小于0.6%，重复性和稳定性较好。利用该方法对4类不同种属的20个兰花样品进行检测，阳性对照在Ct为23.31出现扩增曲线，阴性对照及样品未出现扩增曲线。【结论】基于Taq Man探针的CymRSV实时荧光定量PCR检测方法的成功创建，可为开展兰花CymRSV病毒的精准检测与科学防控提供技术支撑。
关键词： 兰花环斑病毒 TaqMan探针 实时荧光定量PCR 兰花
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