科研产出
蒜芥茄SsWRKY1基因克隆及黄萎病病原菌胁迫下表达分析
《南方农业学报 》 2022 北大核心 CSCD
摘要：[目的]克隆蒜芥茄WRKY1基因(SsWRKY1),并分析其在黄萎病病原菌胁迫下的表达模式,为探究WRKY1基因在野生蒜芥茄黄萎病抗性中的调控机制提供理论参考.[方法]利用染色体步移技术克隆SsWRKY1基因,通过在线生物信息学软件进行序列分析及构建系统发育进化树;采用GFP融合蛋白表达法对WRKY1蛋白进行亚细胞定位,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测SsWRKY1基因在不同组织及接种黄萎病病原菌后不同时间的相对表达量.并分析9种野生茄材料接种黄萎病病原菌后的病情指数与WRKY1基因表达变化量的相关性.[结果]克隆获得的SsWRKY1基因(GenBank登录号MZ846202)ORF序列长度为1224 bp,编码407个氨基酸残基,蛋白相对分子量为44.87 kD,理论等电点(pI)为6.91,属于亲水性不稳定蛋白,亚细胞定位于细胞核,符合转录因子特征.Ss-WRKY1蛋白含有2个WRKY保守结构域和C2H2型锌指结构,属于Ⅰ类WRKY转录因子,其二级结构主要由α-螺旋(7.13%)、β-折叠(4.67%)、无规则卷曲(73.71%)和延伸链(14.50%)组成.SsWRKY1蛋白与番茄、野生潘那利番茄、野生番茄、马铃薯WRKY1蛋白的亲缘关系较近.SsWRKY1基因在根和茎的相对表达量显著高于叶中的相对表达量(P<0.05,下同).黄萎病病原菌接种后不同时间,SsWRKY1基因的相对表达量均低于对照组(无菌水接种),但仅在24 h时二者差异达显著水平.9种野生茄材料接种黄萎病病原菌后的病情指数与接种前后WRKY1基因表达变化量间呈显著正相关.[结论]SsWRKY1属于第Ⅰ类WRKY转录因子,序列高度保守,在细胞核中表达,其基因具有组织表达特异性,黄萎病菌胁迫后该基因的表达下调,推测WRKY1在野生茄黄萎病抗性中起负调控作用.
关键词： 蒜芥茄 WRKY转录因子 黄萎病 基因克隆 亚细胞定位 表达分析
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滇水金凤LWD基因的克隆及表达分析
《热带作物学报 》 2022 北大核心 CSCD
摘要：WD40是转录因子大家族,具有调节花青素苷生物合成、植物生长发育及非生物胁迫响应等功能,LWD(LIGHT-REGULATED WD)基因是该家族中已知的生物钟调节因子,但目前有关植物LWD基因的报道较少,其功能还有待深入研究.为探究LWD基因对滇水金凤花色的影响,本研究以滇水金凤花器官为材料,采用RT-PCR等技术克隆得到2个滇水金凤LWD基因,分别命名为IuLWD1和IuLWD2,其cDNA全长分别为1041 bp和1032 bp,分别编码347个和344个氨基酸.基本理化性质分析显示,IuLWD1和IuLWD2的GC含量分别为46%和50%,相对分子量分别为38838.47 kDa和39029.65 kDa,理论等电点分别为4.71和4.70.IuLWD1和IuLWD2的不稳定指数分别为53.60和52.58,均属于不稳定蛋白;其总平均亲水指数分别为–0.388和–0.366,均为亲水性蛋白.结构域分析显示,IuLWD1和IuLWD2均含有6个典型的WD40-repeat保守结构域,属于WD40超家族.多序列比对发现,IuLWD1和IuLWD2氨基酸序列与牡丹、葡萄及杨梅等氨基酸序列相似度较高.系统发育分析表明,IuLWD1与葡萄和牡丹聚为一支,同源性达85%;IuLWD2与杨梅聚为一支,同源性达90%,然后共同聚类在一支,推测2个基因为旁系亲缘关系.qRT-PCR分析表明,IuLWD1和IuLWD2基因在4种不同花色滇水金凤及其4个不同发育阶段均有表达,均以深红色表达量最高,白色表达量最低,2个基因的表达量均与花色呈正相关,且IuLWD1基因的表达量高于IuLWD2基因的表达量,表明IuLWD1和IuLWD2基因均在滇水金凤花色素苷的生物合成中发挥了作用,且IuLWD1基因对滇水金凤花色形成的调控作用更强.该研究结果为进一步探究滇水金凤花色形成及变异机理、凤仙花花色改良及新品种培育奠定基础.
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甘蔗HTD2基因的表达特征及基因多态性分析
《作物学报 》 2022 北大核心 CSCD
摘要：分蘖是无性繁殖经济作物-甘蔗最重要的农艺性状之一,挖掘分蘖关键基因用于甘蔗理想株型调控是增加品种产量的重要途径.本研究使用实时荧光定量PCR技术对前期从甘蔗中获得的与水稻分蘖关键基因HTD2高度同源的ScHTD2基因开展表达特征分析,然后探讨其在甘蔗种质资源群体中的基因多态性情况,筛选与分蘖性状相关的变异位点.结果显示,该基因表达具有组织特异性,在叶中表达最高;腋芽萌动发育过程中,在休眠芽中表达量最高,随着蔗芽萌动,开始显著下调表达,负调控蔗芽的萌动发育;植物激动素、生长素和独脚金内酯都能显著诱导该基因在萌动蔗芽和蔗苗分蘖芽中的表达,结合激素处理的表型变化特征,预示生长素和独脚金内酯诱导该基因的高表达会抑制萌动蔗芽的继续发育和延迟蔗苗的分蘖,但植物激动素诱导的高表达并没有这种抑制效应.对从26份甘蔗种质资源中获得的520条HTD2基因组DNA克隆序列开展基因多态性分析表明,在基因组结构上,该基因具有2个外显子和1个内含子,其中内含子区域变异最为丰富.从群体基因多态性看,原始种亲本群体在外显子1和2区域表现出较高的核苷酸多样性,而主栽品种群体在内含子区域表现出较高的核苷酸多样性.从编码区单倍型多样性来看,原始种亲本群体间单倍型多样性最为丰富,其次为主栽品种群体.基因选择性测验中,原始种亲本群体受正向选择,选择压力较大,基因进化速度快,而骨干亲本群体和主栽品种群体受负向选择,向纯化方向发展.编码区单倍型演化分析表明,Hap3和Hap4处于单倍型演化的辐射中心,属于较为原始的类型.基因编码区变异位点与分蘖率相关性检测揭示该基因有23个SNP位点和5个InDel位点不同变异类型剂量与甘蔗种质资源分蘖率呈显著相关,变异类型剂量效应将是未来甘蔗分子辅助育种重要的关注点.研究为进一步深入解析甘蔗分蘖调控关键基因的功能作用和开发功能性标记奠定了重要基础.
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琥珀蚕丝腺转录因子基因AaSGF-1的克隆、原核表达及组织表达分析
《昆虫学报 》 2021 北大核心 CSCD
摘要：[目的]本研究旨在克隆琥珀蚕Antheraea assama丝腺转录因子基因AaSGF-1,分析其序列特征及表达模式并制备多克隆抗体,为探讨该基因的生理功能奠定基础.[方法]采用RT-PCR和RACE技术从琥珀蚕丝腺中克隆AaSGF-1的cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用qPCR检测AaSGF-1在琥珀蚕5龄第4天幼虫不同组织(头、中肠、脂肪体、丝腺、血液、表皮)中的表达模式;构建原核表达质粒载体,在大肠杆菌Escherichia coli BL21中表达AaSGF-1,利用纯化的融合蛋白免疫新西兰兔子,获得高效的抗体.利用免疫荧光技术检测AaSGF-1在琥珀蚕蚁蚕丝腺和表皮及4龄幼虫丝腺中的表达情况.[结果]克隆了琥珀蚕AaSGF-1的cDNA序列(GenBank登录号:MK889510.1),开放阅读框(ORF)序列长1 050 bp,编码349个氨基酸残基,预测蛋白分子质量为38.8 kD,理论等电点(pI)为8.74.qPCR检测结果显示AaSGF-1在琥珀蚕5龄幼虫丝腺组织尤其是后部丝腺中高量表达,而在其他组织中几乎不表达.免疫荧光结果表明AaSGF-1在蚁蚕及4龄幼虫的丝腺中表达.[结论]本研究原核表达了琥珀蚕AaSGF-1,制备了多克隆抗体,证实了AaSGF-1在琥珀蚕幼虫的丝腺中高表达,为进一步研究该基因在琥珀蚕丝腺发育及丝蛋白合成中的作用奠定了基础.
关键词： 琥珀蚕 丝腺转录因子 基因克隆 原核表达 多克隆抗体 组织表达谱
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蓖麻GRF转录因子家族生物信息学鉴定及表达分析
《分子植物育种 》 2021 北大核心 CSCD
摘要：GRF是植物特有的转录因子,主要参与调控植物生长发育过程。本研究利用生物信息方法对蓖麻GRF （RcGRF）基因进行全基因组鉴定,并对其理化性质、基因结构、保守结构域、系统发育、组织表达分析以及外源赤霉素（GA）和多效唑（PAC）处理两个蓖麻品种（高杆‘滇蓖2号’和矮杆‘滇蓖5号’）后顶端嫩茎转录组测序分析。结果表明,蓖麻共有9个GRF转录因子,蛋白长度233～617 aa,等电点（pI）为6.34～9.48,每个成员含有2～4个内含子,每个RcGRF的蛋白结构域均包括一个由39～43个氨基酸组成的WRC保守结构域和一个由34个氨基酸组成QLQ保守结构域。系统发育分析表明蓖麻与拟南芥GRF的亲缘关系比水稻更近。不同组织表达结果表明多数RcGRF基因在发育的胚乳及萌发的种子中高表达,而RcGRF2在叶片、雄花和萌发的种子中都不表达。GA和PAC处理转录组测序结果显示GA处理DB2 RcGRF1、DB2 RcGRF17下调表达,GA处理DB5 RcGRF1、DB5 RcGRF4下调表达,PAC处理DB2 RcGRF4、DB2 RcGRF6上调表达、RcGRF9下调表达,表明RcGRF1、RcGRF4、RcGRF7、RcGRF9可能通过赤霉素途径调节植物株型。本研究为蓖麻GRF基因对生长发育调控机理研究奠定分子基础,为调控蓖麻株高相关基因的研究提供科学依据。
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非洲菊CAD基因的克隆及在非生物胁迫下的表达
《应用与环境生物学报 》 2021 北大核心 CSCD
摘要：为揭示非洲菊肉桂醇脱氢酶基因（GjCAD）的序列特性及其在非生物胁迫下的表达模式,利用反转录PCR（RTPCR）从非洲菊品种‘玲珑’中克隆获得两个GjCADs（GjCAD3和GjCAD5）,分析它们及其编码蛋白序列特性,并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术研究它们在不同组织器官（根、叶和叶柄）和不同逆境处理（4℃低温、PEG模拟干旱、水杨酸和NaCl处理）下的表达情况.结果显示:GjCAD3和GjCAD5编码序列（CDS）长度分别为1 089 bp和1 077bp,它们编码的蛋白均不含信号肽和跨膜结构域,其中GjCAD3属于MDR超家族,为亲水蛋白;GjCAD5属于PLN02514超家族,为疏水蛋白. qRT-PCR结果显示,GjCAD3和GjCAD5均在根中表达量最高,其次为叶柄,叶最低.低温处理下,GjCAD3除在处理24h后的表达量显著低于对照外,其余时间点均显著高于对照,而GjCAD5的表达则受到显著抑制;干旱处理下,GjCAD3的表达受到显著抑制,而GjCAD5在处理1 h和12 h的表达量显著高于对照,其余时间点与对照相差不大;SA处理下,GjCAD3的表达受到显著抑制,GjCAD5也仅在处理24 h的表达量显著高于对照;盐胁迫处理下,GjCAD3受到显著抑制,而GjCAD5受到显著诱导.本研究表明GjCAD3和GjCAD5参与非洲菊非生物胁迫应答,但二者表达模式差异较大.该结果可为揭示非洲菊CAD基因的功能奠定基础.（图7表1参37）
关键词： 非洲菊 肉桂醇脱氢酶 基因克隆 非生物胁迫 基因表达
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花青素合成相关基因在二倍体彩色马铃薯薯肉中的表达分析
《分子植物育种 》 2021 北大核心 CSCD
摘要：为了探究彩色马铃薯薯肉颜色分布的机理,本试验利用RT-PCR技术,检测了与花青素合成相关的6种结构基因和4种调节基因,在彩色马铃薯杂交组合后代中不同薯肉颜色个体以及同一薯块中不同薯肉颜色部分的表达情况,研究这些结构基因和调节基因在薯肉中的表达模式。结果显示,在75个杂交后代中,除结构基因DFR外,其余5个结构基因在红色和紫色薯肉中都有较高的表达量,而在81%（StCHS）～93%（StF3H）黄色或白色薯肉中表达量比较低甚至不表达;4个调节基因在90%（StAN2）～100%（StMBA113）黄色或白色薯肉以及所有紫色（除G17-23-36外）和红色薯肉中都有表达。本研究结果表明,来自同一父母本的后代薯肉颜色的差异可能是由结构基因表达量的差异或者在花青素合成通路存在结构基因没有表达而导致,而且4个调节基因可能并不是限制花青素合成的关键转录因子。
关键词： 彩色马铃薯（Solanum tuberosum L.） 花青素合成 RT-PCR 表达分析
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蒜芥茄SsVe1和SsVe2基因的克隆及表达分析
《分子植物育种 》 2021 北大核心 CSCD
摘要：黄萎病是危害茄子生产的主要病害之一,对黄萎病抗性基因研究是解决该病危害严重的有效途径。本研究以黄萎病抗性材料野生蒜芥茄（Solanum sisymbriifolium）为研究对象,在前期转录组测序的基础上,通过RT-qPCR技术克隆得到2个Ve同源基因的c DNA全长,分别命名为SsVe1和SsVe2。其中,SsVe1 cDNA序列有3 615 bp,含3 168 bp开放阅读框,编码1 061个氨基酸;SsVe2 cDNA序列有3 756 bp,含3 456 bp开放阅读框,编码1 157个氨基酸。2个Ve基因所编码的氨基酸具有极高的相似性,均富含抗病基因共有的结构域—亮氨酸重复序列（LRR）,可编码R蛋白;亚细胞定位预测基因产物均在细胞壁上;此外,2个基因编码蛋白的二级、三级结构预测结果也高度相似,以上结果预示着SsVe1和SsVe2功能的相似性。与已报道的其它植物Ve基因对比分析结果表明:SsVe1和SsVe2基因与野生茄S. torvum中Ve基因的关系较近。实时荧光定量PCR检测结果表明:蒜芥茄接种大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）后,SsVe1和SsVe2均表现出先下调（0～12 h）后上调（12～48 h）的趋势;同时,Ve基因在蒜芥茄不同组织中的表达有一定的差异,SsVe2基因的表达量高于SsVe1,且两者在根、茎部的表达量高于叶片。本研究结果为探究Ve基因在茄子黄萎病抗性分子机制中的作用和功能奠定了基础。
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中国桔梗PgF3'5'H及其突变型基因在毕赤酵母中的表达差异分析
《分子植物育种 》 2021 北大核心 CSCD
摘要：F3’5’H是催化合成蓝色花色素的关键酶,F3’5’H蛋白序列中一段编码9个氨基酸的特殊序列区段可能与F3’5’H催化合成的蓝色花色素有关,但该特殊序列区段的催化功能和作用机制尚不清楚。为了探究PgF3’5’H中,该特殊序列结构的催化功能及作用机制,本研究通过重叠延伸PCR技术去除PgF3’5’H编码的9个氨基酸特殊序列区段,获得缺失突变型基因;将PgF3’5’H野生型及其突变型基因同时导入毕赤酵母;通过qRT-PCR检测野生基因及其突变基因在酵母中转录水平基因表达量的差异;通过SDS-PAGE检测PgF3’5’H野生型基因及其突变型基因在酵母中的合成蛋白量的差异。qRT-PCR分析结果显示PgF3’5’H野生型基因较其突变型在酵母中呈现更高的表达量;SDS-PAGE电泳结果显示重组子分泌生成了分子量大小约为52.020k20D的目标蛋白,且野生型蛋白量相比其突变型蛋白量高。因此,推测Pg20F3’5’H蛋白序列中9个氨基酸的特殊序列与调控该基因在RNA和蛋白水平的表达量有关,进而可能影响该基因的催化功能。研究结果将为观赏植物蓝色花色形成分子机制及蓝色花色分子育种提供一定研究基础。
关键词： 中国桔梗 PgF3’5’H 毕赤酵母 基因表达 蛋白表达
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家蚕丝氨酸蛋白酶基因BmSPH33对BmNPV诱导的免疫响应
《西南农业学报 》 2021 北大核心 CSCD
摘要：【目的】了解BmSPH33基因在家蚕免疫应答方面的作用。【方法】BmSPH33基因进行生物信息学分析;利用GeneDoc与MEGA 5.0软件对BmSPH33与其它物种SPH33进行多序列比对和系统进化分析;利用半定量RT-PCR对其组织转录情况进行分析; qRT-PCR检测家蚕添食BmNPV后BmSPH33基因的表达情况。【结果】BmSPH33基因ORF全长840 bp,其氨基酸序列长度为279 aa,软件预测无信号肽序列,分子量大小为22.95 kDa,等电点为5.98。氨基酸序列同源性比较发现,BmSPH33与蓓带夜蛾SPH33含有保守的类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶结构域;组织转录情况表明,该基因在家蚕幼虫的中肠组织特异表达。BmSPH33在家蚕感染BmNPV 4 h时转录水平升高,在8、12、24和48 h时均表现为下调,表明BmSPH33的表达受到BmNPV感染的诱导。【结论】BmSPH33在家蚕感染BmNPV后发生响应,推测该基因参与家蚕免疫应答。
关键词： 家蚕 BmSPH33基因 表达 BmNPV感染 转录分析
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