科研产出
滇龙胆GrWRKY5基因的克隆和植物表达载体构建
《广西植物 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：WRKY蛋白是目前被广泛研究的一类DNA特异结合转录因子,在植物次生代谢物生物合成、植物生长和发育及衰老等生理过程以及生物、非生物防御反应中起重要的调控作用。该研究从滇龙胆幼叶中克隆萜类合成的关键转录因子基因Gr WRKY5,并利用生物信息学方法对基因功能进行预测,构建植物过表达载体。结果表明:根据三年生滇龙胆转录组Gr WRKY5基因序列,设计特异性引物,通过RT-PCR扩增Gr WRKY5 ORF序列,并进行TA克隆、测序和序列分析;构建入门载体p ENTRTM2B-Gr WRKY5,经LR反应后构建植物过表达载体。Gr WRKY5 ORF全长591 bp,编码196个氨基酸,Gen Bank登录号为KF922375,其中第167与170之间的色氨酸(W)、精氨酸(R)、赖氨酸(K)、酪氨酸(Y)组成WRKY蛋白所特有的"WRKY"结构。序列分析表明Gr WRKY5是WRKY超家族的成员。经生物信息学在线软件分析发现,Gr WRKY5的等电点为6.29,脂肪族指数为61.37,不稳定指数为57.80。总平均疏水性为-0.708,为亲水蛋白;含有20种氨基酸,其中天冬氨酸(Asp)和脯氨酸(Pro)含量最高,为8.1%;半胱氨酸(Cys)含量最低,仅为1.0%。氨基酸序列系统发育分析表明,Gr WRKY5与拟南芥中WRKY家族中遗传距离最接近的是WRKY27,属于Ⅱe类成员;与Cr WRKY22和Vv WRKY22蛋白的亲缘关系较近;与Jc WRKY47和Tc WRKY27亲缘关系较远;BLASTp结果显示,Gr WRKY5与欧洲油菜Bn WRKY27-1的同源性最高(为69%);与拟南芥Aa WRKY22的一致性最低(仅为31%)。以Gateway入门载体p ENTR2B和目的载体p K2GW7为基础,成功构建了植物过表达载体p K2-35S-Gr WRKY5,该载体的成功构建为该基因在拟南芥、滇龙胆等植物中的遗传转化奠定了基础,同时为WRKY基因功能的深入研究提供依据。
关键词： 滇龙胆 Gr WRKY5 基因克隆 序列分析 植物表达载体构建
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不同复合种植模式滇龙胆中矿质元素化学计量学研究
《河南农业科学 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：为了研究不同复合种植模式滇龙胆的矿质元素计量特征,探讨滇龙胆药材化学成分及其疗效的影响因素,采用电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)法测定4种种植模式(单一种植、茶树+滇龙胆、旱冬瓜+滇龙胆、杉木+滇龙胆)下滇龙胆(根、茎、叶)及其生长土壤中8种矿质元素(B、Ca、Cu、Fe、Mn、Mo、Ni和Zn)的含量,结合多元统计分析方法对其所含元素计量特征进行分析和评价。结果表明,不同种植模式滇龙胆中均含有丰富的Ca、Fe、Mn等多种矿质元素,Mo元素均未检出(<0.15μg/g);单一种植滇龙胆叶中Ca元素含量最高,达8 181μg/g,根中Fe元素含量最高,达2 228μg/g,旱冬瓜+滇龙胆复合种植的叶片中Mn元素含量最高,达910μg/g。同一种植模式滇龙胆根、茎、叶中Ca、Cu、Fe、Mn、Ni元素含量均差异显著(P<0.05)。不同种植模式滇龙胆中Fe、Mn元素含量差异很大。单一种植及旱冬瓜+滇龙胆、杉木+滇龙胆复合种植下,滇龙胆与土壤中部分元素含量具有一定相关性。不同种植模式的滇龙胆对矿质元素的富集能力差异较大,其中对Ca、Cu、Mn、Zn元素的富集能力较强,茶树+滇龙胆种植模式下的叶片对Cu元素的富集能力最强。多元统计分析和滇龙胆生物富集系数分析表明,滇龙胆自身的生物学特性及种植模式影响体内矿质元素的分布特征。
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农林复合系统中滇龙胆形态和生物量变化研究
《广西植物 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：以幼龄茶树(Camellia sinensis var.sinensis)、十年茶树、木瓜(Chaenomeles sinensis)、尼泊尔桤木(Alnus nepalensis)、大叶桉(Eucalyptus robusta)间作模式和荒坡栽培滇龙胆为研究对象,测定其株高、茎粗、叶长、根粗、生物量等性状,采用单因素方差分析、多重比较、相关性分析和多元逐步回归分析对其形态和生物量数据进行分析。结果表明:荒坡栽培、滇龙胆与十年茶树间作其株高最高,为(37.32±8.36)cml和(37.31±9.62)cm,与大叶桉间作其株高最低,为(19.08±12.40)cm;荒坡栽培植株茎粗数值最高,为(0.36±0.13)cm,大叶桉间作茎粗数值最低,为(0.23±0.04)cm;与茶树间作植株根系最长,为(18.42±7.23)cm、和(17.71±7.34)cm,与尼泊尔桤木间作植株须根数最少,为(7.32±2.23).m、;根粗受栽培模式影响不显著(P>0.05);荒坡栽培全株生物量最高,为(14.52±13.37)g,大叶桉间作全株生物量最低,为(2.17±1.42)g。相关性分析显示,株高、茎粗和须根数与全株生物量呈极显著的正相关(R=0.514,P<0.01;R=0.510,P<0.01;R=0.339,P<0.01)。根茎比与全株生物量呈极显著的负相关(R=0.295,P<0.01)。多元逐步回归分析显示,各性状对全株生物量的积累贡献程度不同,株高、茎粗、须根数和根粗是影响滇龙胆生物量积累的主要性状。荒坡栽培光照条件较好,有利于植株生物量的积累;与桉树间作,滇龙胆可能受生物与非生物胁迫的共同影响,使其植株矮小,生物量偏低。6种栽培模式中荒坡、滇龙胆与茶树、木瓜间作栽培为高产模式。研究结果可为农林药用复合种植中物种搭配、时间和空间种植技术优化升级以及管理提供理论依据。
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农林复合系统滇龙胆茎叶化学计量特征研究
《植物科学学报 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：以农林复合系统种植的滇龙胆(Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.)为材料,采用高效液相色谱法建立不同栽培系统滇龙胆茎、叶的色谱指纹图谱,并测定其主要活性成分马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和当药苷含量,研究不同栽培系统滇龙胆茎、叶化学计量特征。采用相关性分析、指纹图谱相似度分析、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)、变量投影重要性准则(VIP)等方法进行化学数据分析。结果显示,滇龙胆主要活性成分马钱苷酸含量为(1.85±0.92)mg/g~(7.43±7.64)mg/g,獐牙菜苦苷含量为(1.03±0.17)mg/g~(1.58±0.50)mg/g,龙胆苦苷含量为(15.28±11.34)mg/g~(24.59±7.84)mg/g,当药苷含量为(4.10±1.64)mg/g~(31.67±22.70)mg/g,且叶片中4种活性成分的总含量高于茎;不同栽培系统中,与尼泊尔桤木间作的滇龙胆茎、叶活性成分总含量最高,而与核桃间作的滇龙胆茎、叶活性成分总含量最低。相关性分析显示,植株相同部位和不同部位间的环烯醚萜和裂环烯醚萜含量呈显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)正相关。指纹图谱相似度分析表明,不同栽培系统滇龙胆茎指纹图谱相似度介于0.989~0.992之间、叶指纹图谱相似度为0.988~0.996,相同部位样品化学成分种类相似。PLS-DA分析结果表明,茎和叶片整体化学计量特征具有明显差异;单作及林药间作的样品被区分为不同类群,不同间作模式下滇龙胆茎、叶化学成分具显著差异,叶片高效液相色谱指纹图谱可用于区分不同栽培系统滇龙胆样品。本研究结果可为农林复合系统滇龙胆有效成分含量研究及滇龙胆资源的合理开发利用提供科学依据。
关键词： 滇龙胆 农林复合系统 茎叶 色谱指纹图谱 化学计量特征
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栽培滇龙胆药材不同极性部位紫外吸收光谱特征与判别分析
《中国实验方剂学杂志 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：目的:建立滇龙胆药材不同极性部位的紫外指纹图谱,分析不同栽培模式下药材光谱特征的差异。方法:采用紫外分光光度法检测样品的紫外吸收光谱数据,经过4点平滑和一阶求导对光谱数据进行预处理,建立紫外指纹图谱。运用共有峰率和变异峰率双指标序列分析法对不同栽培模式下滇龙胆药材的指纹特征及相似性进行评价,通过判别分析评价紫外指纹图谱区分药材栽培模式的能力。结果:不同栽培模式滇龙胆紫外指纹图谱在221~247 nm图谱重叠率低,呈现明显指纹特征;相同栽培模式下,滇龙胆醇提液与水提液紫外指纹图谱有差异,呈现药材不同极性部位的指纹特征。荒坡栽培和龙胆与木瓜间作2种模式下,药材化学成分的光谱特征较接近;荒坡栽培和龙胆与旱冬瓜间作模式下,药材化学成分变化较大,二者光谱特征具明显差别。来自不同栽培模式的滇龙胆样品90%能被正确识别。结论:滇龙胆药材不同极性部位紫外指纹图谱可协助区分药材栽培模式,为不同栽培模式下药材质量的等同性研究提供相关数据信息。
关键词： 紫外指纹图谱 判别分析 栽培模式 滇龙胆 质量控制
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滇龙胆与青叶胆环烯醚萜类物质计量特征分析
《植物分类与资源学报 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：龙胆科龙胆属滇龙胆(Gentiana rigescens)与獐牙菜属青叶胆(Swertia mileensis)为我国特有种。采用高效液相色谱法测定其中马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和当药苷含量,结合多变量分析研究环烯醚萜类成分含量及其构成比例在龙胆科植物种内和种间的差异。研究结果显示,4种环烯醚萜类成分的计量特征呈现种间差异,依据环烯醚萜类成分含量及其构成比例,所有滇龙胆样品可分为4类。马钱苷酸含量与纬度呈极显著负相关(R=-0.348,P<0.05),与海拔呈极显著正相关(R=0.307,P<0.01);獐牙菜苦苷含量与经度呈极显著负相关(R=-0.592,P<0.01),高海拔有利于植株中当药苷构成比例的增加(R=0.245,P<0.05);地理因子对植株中龙胆苦苷含量变化影响不显著(P>0.05)。
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红外光谱在滇龙胆干燥方法选择上的应用
《时珍国医国药 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：目的筛选滇龙胆的最佳干燥方法。方法采用傅里叶变换红外光谱法(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)结合多元统计分析对晒干(GZCK)、发汗干燥(FZ)、45℃烘箱干燥(HZ45)、微波干燥(WZ)及室内阴干(YG)5种干燥方法处理的45份滇龙胆样品进行分析。结果精密度、稳定性及重现性试验的匹配值在99.33~99.90之间,RSD≤0.01%,表明该法稳定可靠。谱峰比较发现,晒干处理样品在龙胆苦苷的两个主要特征吸收峰1 611和1 075 cm-1附近吸光度值比其它干燥处理的高,表明晒干有利于滇龙胆中龙胆苦苷的保留。原始光谱经自动平滑+自动基线校正+Norris平滑(5∶5)+二阶求导预处理并进行偏最小二乘判别分析(Partial least square discriminant analysis,PLS-DA),结果显示同一干燥处理的样品相对聚集,判别效果较好。谱图检索显示相同干燥方法处理的样品匹配正确率为93.3%,表明该法用于分析不同干燥方法的滇龙胆样品效果较理想。结论晒干是滇龙胆的最佳干燥方法。该法可直观有效地评价中药干燥方法的优劣。
关键词： 滇龙胆 干燥方法 傅里叶变换红外光谱 谱图检索 偏最小二乘判别分析
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林药复合栽培滇龙胆HPLC指纹图谱计量特征与质量评价
《中国药学杂志 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：目的建立不同栽培模式滇龙胆的HPLC指纹图谱,对马钱苷酸,獐牙菜苦苷,龙胆苦苷和当药苷进行定性、定量分析;结合化学计量学对林药复合栽培滇龙胆资源进行评价。方法色谱柱为岛津Shim-pack VP-ODS液相色谱柱(4.6 mm×150mm,5μm),流动相:0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B),梯度洗脱,流速1.00 m L·min-1,柱温30℃,检测波长241 nm,进样量10μL。化学计量学分析方法包括:系统聚类分析、偏最小二乘判别分析和变量投影重要性准则。结果龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、当药苷和马钱苷酸在10~4 000μg·m L-1内线性良好,相关系数为0.999 2~0.999 9;4种化学成分精密度的RSD分别为0.87%,2.1%,0.90%和2.4%;重复性实验的RSD分别为0.97%,1.9%,2.0%和2.2%;稳定性实验的RSD均小于2.2%;加样回收率在97.12%~103.81%之间,RSD在0.71%~2.0%之间。指纹图谱相似性分析显示多数样品相似性系数大于0.970,不同栽培模式的70份样品化学成分种类相似,含量有明显变化;栽培药材龙胆苦苷>獐牙菜苦苷>马钱苷酸>当药苷,龙胆苦苷计量特征与其余3种活性成分差别较大。滇龙胆与尼泊尔桤木复合栽培模式下,药材4种化学成分总含量最高;与核桃树复合栽培有利于马钱苷酸的积累,与桉树复合栽培有利于獐牙菜苦苷的积累,与杉木复合栽培有利于当药苷的积累。以上结果表明,针对不同化学成分,应有多种最佳栽培模式。偏最小二乘判别分析和变量投影重要性准则研究显示,龙胆苦苷(VIP=1.513),獐牙菜苦苷(VIP=1.208)和保留时间在10 min后的化学成分对药材栽培模式的区分具有显著贡献。结论 HPLC指纹图谱结合化学计量学可为滇龙胆林药复合栽培最佳模式的选择及质量控制提供方法和理论依据。
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滇龙胆甲羟戊酸激酶基因的克隆与表达分析
《生命科学研究 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：甲羟戊酸激酶是甲羟戊酸途径的关键酶。根据滇龙胆转录组甲羟戊酸激酶基因Gr MK序列,设计一对基因特异性引物克隆该基因,并进行序列分析;构建原核表达载体p GEX-4T-1-Gr MK,转入大肠杆菌Rosetta(DE3),重组蛋白在37℃、1.0 mmol/L IPTG诱导下成功表达。生物信息学分析结果表明,Gr MK蛋白为甲羟戊酸激酶家族成员,具有MK蛋白保守结构域:乳糖激酶/高丝氨酸激酶/甲羟戊酸激酶/磷酸甲羟戊酸激酶(GHMP kinase)N端结构域、C端结构域和ATP结合结构域;Gr MK与长春花Cr MK亲缘关系最近.原核表达结果表明,融合蛋白相对分子质量与推断大小一致。组织特异性表达分析结果表明Gr MK基因主要在根中表达.这些结果为Gr MK蛋白结构和功能的研究奠定基础。
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野生和栽培滇龙胆主要活性组分含量特征及质量评价
《药物分析杂志 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：目的:建立滇龙胆高效液相色谱(HPLC)图谱,测定有效成分含量,结合化学计量学对野生和栽培药材进行质量评价。方法:采用Shim-pack VP-ODS液相色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm),以0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相,梯度洗脱(0~5 min,5%B;5~10 min,5%B→10%B;10~26 min,10%B→26%B;26~30 min,26%B→35%B),流速1.00 m L·min-1;柱温30℃;检测波长241 nm,进样量5μL。采用系统聚类,相似度分析和偏最小二乘判别对化学数据进行统计分析。结果:27批药材马钱苷酸含量为5.375 mg·g-1(S12)~20.234 mg·g-1(S3),獐牙菜苦苷含量为2.246 mg·g-1(S7)~9.653 mg·g-1(S18),龙胆苦苷含量为24.252 mg·g-1(S19)~128.350 mg·g-1(S25),当药苷含量为0.510 mg·g-1(S12)~3.498 mg·g-1(S8);当药苷在4种活性成分中含量最低;所有样品依照4种化学成分的含量特征可分为a、b、c 3类;a类包括大部分野生样品和栽培2年的滇龙胆,贵州的样品(S19)被单独归为b类,c类主要为3年生样品;相似度分析显示大部分样品相似度大于0.930,野生和栽培样品化学成分种类相似,但含量有明显变化;以14个共有峰峰面积为变量,进行偏最小二乘判别分析,建立PLS-DA模型,结果显示野生和栽培样品能被正确区分;栽培3年滇龙胆环烯醚萜与裂环烯醚萜类成分总含量最高,质量稳定,品质最佳。结论:高效液相色谱图谱与多指标化学成分定量相结合可为野生和栽培滇龙胆药材质量控制和评价提供科学依据。
关键词： 滇龙胆 环烯醚萜 裂环烯醚萜 聚类分析 野生样品 栽培样品 特征图谱分析 马钱苷酸 獐牙菜苦苷 龙胆苦苷 当药苷
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