科研产出
滇龙胆甲羟戊酸二磷酸脱羧酶基因的克隆与表达分析
《贵州农业科学 》 2015 北大核心
摘要：为获得滇龙胆GrMDC基因序列,以滇龙胆转录组为基础,采用RT-PCR技术从滇龙胆幼叶克隆GrMDC基因,并进行原核表达和组织特异性表达分析。结果表明:滇龙胆GrMDC基因(登录号KJ917169)全长1 275bp,GrMDC蛋白相对分子量为46.77kD,pI为5.97;该蛋白可能定位于细胞质,无信号肽,为亲水不稳定蛋白,主要由α-螺旋和无规则卷曲构成;GrMDC蛋白与长春花CrMDC蛋白相似性较高(88.12%),且亲缘关系最近;GrMDC基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为72.77kD(含GST标签26kD),与预期蛋白大小一致;GrMDC基因主要在根中表达。
关键词： 滇龙胆 甲羟戊酸二磷酸脱羧酶 基因克隆 原核表达 组织特异性表达
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固相萃取-HPLC法同时测定滇龙胆中7种苯甲酸酯
《分析试验室 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：建立了固相萃取-HPLC法同时测定滇龙胆中抗老年痴呆的7种主要成分gentiside G,gentiside H,gentiside I,gentiside A,gentiside J,gentiside B,gentiside K的含量的方法。滇龙胆样品经乙醇提取环己烷萃取后,用硅胶固相萃取小柱净化,HPLC-DAD对7种苯甲酸酯进行定量检测。7种苯甲酸酯类化合物在一定范围内线性关系良好,相关系数均大于0.999,加样回收率为92.8%~104.6%,RSD为0.8%~4.7%。不同产地龙胆样品中云南产滇龙胆苯甲酸酯含量高于其他产地龙胆,7种化合物中,gentiside B含量最高达0.3425μg/g,gentiside G含量最低只有8.5μg/g。方法为滇龙胆药材的质量控制和资源开发利用提供科学依据。
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大理苍山不同海拔梯度和土壤对野生滇龙胆生长及其成分的影响
《西南农业学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：研究了9个不同海拔梯度(2203~3327 m)野生滇龙胆的表型性状、生物量及龙胆苦苷含量。结果表明,滇龙胆植株表型性状与不同海拔梯度间相关性不显著;海拔2 783 m时,单株地上部干重和单株地下部干重之比为0.99,即地上和地下部干重基本相等;其余海拔梯度均为单株地上部干重高于单株地下部干重,海拔3046 m时,滇龙胆地上部干重是地下部干重的2.56倍;地下部龙胆苦苷含量均高于地上部龙胆苦苷含量,除了海拔3327 m处龙胆苦苷含量地下部与地上部之比仅为1.46倍之外,其余海拔梯度滇龙胆地下部龙胆苦苷含量均是地上部龙胆苦苷含量的2倍以上;相关分析表明,滇龙胆龙胆苦苷含量与土壤养分含量和海拔梯度相关性不显著。
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滇龙胆1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因GrDXR的克隆、序列分析与原核表达
《中草药 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：目的从滇龙胆Gentiana rigescens幼叶中克隆萜类合成关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因GrDXR,进行序列分析和原核表达。方法根据滇龙胆转录组中GrDXR基因序列,设计引物,通过RT-PCR扩增得到GrDXR开放阅读框(ORF)序列,并进行TA克隆、测序和序列分析;构建原核表达载体pGEX-4T-1-GrDXR,转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,在IPTG诱导下进行表达。结果 GrDXR ORF全长1 425 bp,编码474个氨基酸。序列分析表明,GrDXR基因是DXR家族成员;蛋白质序列系统发育分析表明,GrDXR与萝芙木RvDXR、橡胶树HbDXR和长春花CrDXR亲缘关系较近。构建pGEX-4T-1-GrDXR重组质粒,获得稳定的原核表达体系。SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。结论克隆了GrDXR基因,建立其稳定的原核表达体系,为进一步纯化GrDXR蛋白,研究其结构和功能奠定基础。
关键词： 滇龙胆 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因 基因克隆 序列分析 原核表达
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滇龙胆GrGPPS基因的克隆及其序列分析与原核表达
《中草药 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：目的从滇龙胆Gentiana rigescens幼叶中克隆单萜化合物合成的关键酶牻牛儿基焦磷酸合成酶基因GrGPPS,进行序列特征分析和原核表达。方法根据三年生滇龙胆转录组GrGPPS基因序列,设计特异性引物,通过RT-PCR扩增得到GrGPPS cDNA序列,并进行TA克隆、测序及序列分析;构建原核表达载体pGEX-4T-1-GrGPPS,转入Escherichia coli Rosetta(DE3)中,在37℃、1.0 mmol/L IPTG诱导下进行表达。结果 GrGPPS cDNA全长1 107 bp,编码369个氨基酸;序列分析表明,GrGPPS基因是异戊烯基合成酶家族的成员;氨基酸序列系统发育分析表明,GrGPPS与金鱼草AmGPPS亲缘关系最近;构建pGEX-4T-1-GrGPPS重组质粒,获得稳定的pGEX-4T-1-GrGPPS原核表达体系。SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。结论克隆了GrGPPS基因,建立pGEX-4T-1-GrGPPS稳定的原核表达体系,为进一步纯化和鉴定GPPS蛋白并研究其结构和功能奠定基础。
关键词： 滇龙胆 牻牛儿基焦磷酸合成酶基因 基因克隆 序列分析 原核表达
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滇龙胆GrSLS1基因的克隆与原核表达
《西北植物学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：以滇龙胆转录组为基础,采用RT-PCR技术克隆了滇龙胆幼叶裂环番木鳖苷合酶基因,命名为GrSLS1(GenBank登录号KF941191)。序列分析结果显示,GrSLS1基因开放阅读框长1 560bp,编码519个氨基酸;GrSLS1蛋白相对分子量为59.33kD,pI为8.96。生物信息学分析结果表明,GrSLS1蛋白属于SLS家族成员,其N端含有一跨膜螺旋区域(10~32);二级结构分析结果表明,GrSLS1蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲组成;系统发育分析表明,GrSLS1与帽柱木MsSLS2蛋白亲缘关系最近。构建原核表达载体pGEX-4T-GrSLS1,对GrSLS1基因进行原核表达,SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。该研究为进一步研究GrSLS1基因功能及通过在龙胆中过表达该基因提高龙胆苦苷含量奠定基础。
关键词： 滇龙胆 GrSLS1基因 基因克隆 序列分析 原核表达
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LC-MS/MS法同时测定滇龙胆中4种苯甲酸酯类成分
《中成药 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：目的建立LC-MS/MS法同时测定滇龙胆中抗老年痴呆的4种主要成分gentiside A,gentiside J,gentiside B,gentiside K的量。方法使用岛津LC-MS/MS 8030液质联用仪,色谱柱为Shim-pack XR-ODSⅢ(75 mm×2.0 mm,1.6μm);流动相为甲醇-0.1%甲酸,等度洗脱;离子源为电喷雾电离源(ESI),采用负离子多反应监测模式。结果Gentiside A,gentiside J,gentiside B,gentiside K分别在39.0~444.4μg/m L、39.0~444.4μg/m L、59.0~444.4μg/m L、26.0~444.4μg/m L范围内线性关系良好,相关系数为0.998 9~0.999 6;所测的滇龙胆根部中,4种苯甲酸酯类成分的含有量分别为0.284、0.358、0.654、0.267 mg/g;加样回收率为98.1%~102.6%,RSD为0.7%~1.7%。结论该方法专属性好、精密度高,可用于滇龙胆中苯甲酸酯类成分的检测。
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滇龙胆GrCYP450-17基因的克隆、序列分析与原核表达
《中草药 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：目的从滇龙胆幼叶中克隆萜类合成相关酶基因GrCYP450-17,进行序列分析和原核表达。方法根据滇龙胆转录组中GrCYP450-17基因序列,设计引物,通过RT-PCR扩增得到GrCYP450-17开放阅读框(ORF)序列,并进行TA克隆、测序和序列分析;构建原核表达载体pGEX-4T-1-GrCYP450-17,转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下进行表达。结果 GrCYP450-17 ORF全长1 545 bp,编码514个氨基酸。序列分析表明,GrCYP450-17基因是CYP714家族成员;蛋白质序列系统发育分析表明,GrCYP450-17与番茄SlCYP450亲缘关系最近。构建pGEX-4T-1-GrCYP450-17重组质粒,获得稳定的原核表达体系。SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。结论克隆了GrCYP450-17基因,建立其稳定的原核表达体系,为进一步纯化GrCYP450-17蛋白、研究其结构和功能奠定基础。
关键词： 滇龙胆 GrCYP450-17 基因克隆 序列分析 原核表达
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滇龙胆GrHMA基因的克隆和原核表达
《生命科学研究 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：HMA蛋白(heavy metal transporting ATPase)是一种在植物中广泛存在的多功能蛋白。根据滇龙胆转录组GrHMA基因序列,设计特异性引物,通过RT-PCR扩增GrHMA基因序列,并进行TA克隆、测序及序列分析;构建原核表达载体pGEX-4T-1-GrHMA,转入E.coli Rosetta(DE3)中,并在37℃、1.0 mmol/L IPTG下成功诱导表达。序列分析表明,GrHMA基因是HMA超家族的成员;GrHMA氨基酸序列系统发育分析表明,GrHMA与TcHMA处于同一进化枝。SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。这些结果为GrHMA蛋白的进一步纯化及结构和功能的研究奠定基础。
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云南道地药材滇龙胆资源调查与评价
《植物遗传资源学报 》 2012 北大核心 CSCD
摘要：滇龙胆为云南重要道地药材,通过走访和实地调查对云南省38个县市龙胆资源分布范围及资源现状进行调查。结果表明,滇龙胆在云南省除昭通、德钦和西双版纳外,均有分布,适宜生境为海拔1350～2500m的荒坡或林下。所测种群滇龙胆根粗为0.33～0.44cm,根长7.03～19.79cm,根数为6.34～19.40,根生物量为0.27～1.40g,根中龙胆苦含量为3.56%～5.99%。聚类分析结果显示,除玉溪、昆明、楚雄等产区外,文山、怒江种群滇龙胆质量也较好,具较高开发、利用价值。目前野生滇龙胆生境遭到破坏,资源量锐减,亟待保护,本研究调查为云南滇龙胆资源的保护与利用提供建议和基础数据。
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