科研产出
滇龙胆环烯醚萜氧化酶基因及启动子的克隆与生物信息学分析
《中草药 》 2018 北大核心 CSCD
摘要：目的从滇龙胆叶片中克隆单萜合成关键酶环烯醚萜氧化酶(GrIDO)基因及其启动子序列,并进行序列分析。方法根据滇龙胆转录组GrIDO基因序列设计基因特异性引物,使用RT-PCR方法克隆GrIDO基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,基于在线软件对GrIDO基因序列进行生物信息学分析。同时,根据GrIDO基因ORF序列,设计特异性引物,采用PCR法对该基因启动子序列进行扩增,并进行序列分析。结果 GrIDO基因(GenBank登录号KP722034)ORF全长1 557 bp,编码518个氨基酸;GrIDO蛋白相对分子质量58 920,理论等电点8.40,属于细胞色素P450超家族成员,可能定位于叶绿体;无信号肽,为亲水不稳定蛋白,主要由α-螺旋(51.07%)和环(42.69%)构成;GrIDO蛋白与长春花CrIDO蛋白具有较高的相似性(85.83%),且亲缘关系较近。GrIDO基因启动子(GenBank登录号KT428570)长720 bp,具有TATA-box和CAAT-box,还具有参与脱落酸和茉莉酸甲酯应答的顺式作用元件、光应答元件和MYB结合位点。结论GrIDO基因表达受多种因素调控。克隆了GrIDO基因ORF及其启动子,为GrIDO基因的功能验证奠定基础。
关键词： 滇龙胆 环烯醚萜氧化酶 基因和启动子克隆 生物信息学分析 开放阅读框
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基于数据融合和多指标定量对滇龙胆产地鉴别和质量评价
《中国中药杂志 》 2018 北大核心 CSCD
摘要：中药次生代谢产物积累和产地密切相关,产地鉴别以及多指标评价对保证药材质量具有重要意义。该实验采用高效液相色谱(HPLC)与傅里叶变换红外光谱(FTIR)数据融合结合偏最小二乘判别分析对滇龙胆进行产地鉴别,辅以多指标成分含量分析,以期为滇龙胆药材建立一种全面准确的鉴别和质量评价方法,为滇龙胆最佳产区筛选提供参考。采集云南、四川、广西、贵州共169份样品的FTIR和HPLC指纹图谱,并对FTIR进行多元散射校正、标准正态变量(SNV)、Savitzky-Golay(SG)卷积求导等预处理;比较FTIR,HPLC及低级、中级数据融合鉴别效果;利用HPLC分析样品中龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、马钱苷酸与当药苷含量。结果发现,不同产地滇龙胆FTIR图谱存在差异,最佳预处理为SNV+SG求导(二阶求导,窗口参数为15,多项式次数为2次)。低级、中级数据融合预测集正确率为96.43%,高于FTIR,HPLC预测集正确率94.64%;低级数据融合训练集正确率为100%,优于中级数据融合99.12%。云南滇龙胆4种环烯醚萜苷含量均高于其他省份,其中药典指标性成分龙胆苦苷平均质量分数为47.40 mg·g~(-1),最大值达到79.83 mg·g~(-1),且龙胆苦苷、马钱苷酸与当药苷含量同其他省份含量差异显著(P<0.05)。云南省不同地区滇龙胆4种环烯醚萜苷总含量比较发现,大理洱源、丽江玉龙较高,分别为68.59,66.68mg·g~(-1),同楚雄武定、玉溪澄江、昆明寻甸(52.99,52.29,46.71 mg·g~(-1))差异显著(P<0.05),可作为滇龙胆栽培和优良种质资源筛选的参考地。FTIR-HPLC数据融合定性分析结合HPLC定量分析方法为不同产地滇龙胆鉴别和质量评价提供一种全面准确的新思路,为滇龙胆资源开发与利用提供科学依据。
关键词： 数据融合 高效液相色谱 傅里叶变换红外光谱 滇龙胆 质量评价
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滇龙胆丛芽高效诱导与植株再生体系的建立
《中草药 》 2018 北大核心 CSCD
摘要：目的以滇龙胆Gentiana rigescens带叶茎尖、带芽茎段、叶片、根为外植体,建立滇龙胆高效、稳定的丛芽诱导体系,筛选出适宜的植株再生途径。方法以MS为基本培养基,在单因素实验的基础上,通过L16(45)正交及完全组合实验研究不同外植体和不同植物激素种类及其质量浓度对愈伤组织诱导、丛芽发生及植株再生的影响。结果带芽茎段为间接器官发生最佳材料,其在MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L+KT 0.05 mg/L中培养10 d、节上腋芽开始萌发后,基部可诱导出再分化能力极强的愈伤组织,得愈率为97.73%;15 d后愈伤组织开始分化出绿色丛芽,分化率100%;30 d后不定芽分化系数达18.65,增殖系数可达63.58。带叶茎尖为直接器官发生最佳材料,其在MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 0.5mg/L中培养30 d后,增殖系数亦可达44.36。2种材料培养获得的试管苗茎细瘦弱,不利于生根培养,试管苗在MS+6-BA1.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L+KT 0.05 mg/L+PP333 10 mg/L中培养60 d后可获得健壮度大为改善的复壮苗。复壮苗生根则在1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 2.0 mg/L中进行,45 d后可获得生长健壮的再生植株,生根率100%。再生苗移栽成活率达95%以上。结论建立的滇龙胆无性快速繁殖体系,为保护滇龙胆野生资源、优质种苗繁育提供了有效途径,也为其遗传转化研究奠定了实验基础。
关键词： 滇龙胆 带芽茎段 愈伤组织 复壮培养 无性快速繁殖体系 植株再生体系
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红外光谱技术在滇龙胆栽培方式选择上的应用
《广西植物 》 2017 北大核心 CSCD
摘要：该研究采用傅里叶变换红外光谱结合化学计量学,对条播、撒播、剪根后移栽、扦插和剪枝后移栽的滇龙胆进行了分析,以筛选滇龙胆的最佳栽培方式。结果表明:(1)不同栽培方式的滇龙胆原始谱图在峰形、峰位和峰强上有一定差异;用小波去噪法对光谱进行优化处理并进行偏最小二乘判别分析(Partial least squares discriminant analysis,PLS-DA),能较好地区分不同栽培方式的滇龙胆样品,PLS-DA二维得分图显示同一栽培方式的样品聚在一起,表明相同栽培方式的滇龙胆化学组成和含量差异较小;播种滇龙胆样品(条播和撒播)距离较近,移栽滇龙胆样品(剪根、扦插和剪枝)距离较近,而播种和移栽滇龙胆样品距离较远,表明栽培方式对滇龙胆化学成分的积累有影响。(2)滇龙胆四种主要成分总含量大小依次是剪枝>剪根>撒播>条播>扦插,除剪根后移栽,剪枝后移栽滇龙胆中四种主要成分总含量显著高于其他栽培方式下的滇龙胆(P<0.05),剪枝后移栽滇龙胆质量最佳。(3)以液相数据为参考值,采用正交信号校正—偏最小二乘回归模型预测不同栽培模式滇龙胆中龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷和当药苷的含量。校正集和验证集的决定系数(R2)均大于0.90,校正均方根误差、交叉验证均方差和预测均方根误差均小于1.65,模型相关性和预测效果好,该方法对红外光谱分析在中药领域的推广应用提供了参考。
关键词： 傅里叶变换红外光谱 偏最小二乘判别分析 正交信号校正-偏最小二乘法 栽培方式 滇龙胆
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不同初加工滇龙胆HPLC指纹图谱及其有效成分含量测定
《西南农业学报 》 2017 北大核心 CSCD
摘要：建立不同初加工方法滇龙胆(Gentiana rigescens)样品的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱,并测定其中马钱苷酸、獐芽菜苦苷、龙胆苦苷和当药苷4种有效成分含量,结合化学计量学方法对4种有效成分含量测定结果进行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA),对9种初加工方法进行评价。结果显示,样品间相似度高于0.960。经水洗净后室内通风干燥处理的滇龙胆中獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、当药苷含量最高,分别为(5.89±0.23)、(15.62±0.84)和(3.79±0.16)mg/g,微波带皮处理的滇龙胆中马钱苷酸含量最高,为(8.58±1.48)mg/g,4种有效成分总含量达到(27.67±6.09)mg/g。主成分分析结果显示,前2个主成分累积贡献率为86.822%,与4种有效成分的线性关系为F_((PC1))=-0.003X_1+0.409X_2+0.31X_3+0.398X_4,F_((PC2))=0.875X_1-0.168X_2+0.329X_3-0.078X_4;计算不同初加工滇龙胆的主成分综合得分排名,带皮水洗后室内通风干燥滇龙胆综合得分最高。不同初加工处理对滇龙胆有效成分的含量会产生影响,其中带皮水洗后通风干燥的传统初加工方法对滇龙胆品质影响最小,是理想的初加工方法。
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滇龙胆香叶醇10-羟化酶基因的克隆与表达分析
《西南农业学报 》 2017 北大核心 CSCD
摘要：【目的】克隆滇龙胆香叶醇10-羟化酶基因Gr G10H(geraniol 10-hydroxylase),分析其生物信息学特征、基因结构、蛋白表达和组织表达情况,为龙胆苦苷生物合成途径解析提供理论依据。【方法】通过RT-PCR及基因克隆方法,从滇龙胆总RNA中克隆得到基因Gr G10H及其基因组序列;使用生物信息学方法分析其DNA序列及其编码蛋白特性,使用Clustal X2.1软件对Gr G10H蛋白质及其同源序列做序列比对,使用MEGA7.0软件进行系统发育树构建;利用定量PCR技术分析Gr G10H基因在滇龙胆根茎叶中的表达水平。【结果】使用RT-PCR方法从滇龙胆叶片中克隆得Gr G10H基因全长为1834 bp,包含2外显子和1内含子,ORF1548 bp,将序列提交至Gen Bank,得到序列号KJ418410。生物信息学分析表明,该基因编码515个氨基酸,分子量为57.74 k D,理论等电点为9.02;该蛋白属于细胞色素P450超家族成员,定位于内质网,其N端含一跨膜螺旋(21~43),其中1~20氨基酸残基位于膜内,44~515位于膜外。该蛋白无信号肽,为亲水稳定蛋白,主要由无规则卷曲(44.85%)和α-螺旋(40.58%)构成。Gr G10H蛋白与川西獐牙菜Sm G10H蛋白具有较高的相似性(87%),且亲缘关系最近。原核表达结果表明,Gr G10H基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为83.74 k D(含GST标签26.00 k D),与预期蛋白大小一致。组织特异性表达分析结果表明Gr G10H基因主要在叶中表达。【结论】克隆到滇龙胆Gr G10H基因,并成功在大肠杆菌中表达,推测其在主要叶片中起作用。
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基于灰色关联度分析法的滇龙胆质量评价
《中国实验方剂学杂志 》 2017 北大核心 CSCD
摘要：目的:测定不同来源滇龙胆样品中4种指标成分,结合灰色关联度分析(GRA)法建立其质量评价方法。方法:采用高效液相色谱法测定云南10个不同地区的50株滇龙胆根及根茎中主要药效成分马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和当药苷的含量。基于GRA法处理样品各指标成分数据,计算各评价单元序列相对于参考序列的相对关联度作为测度,对样品进行综合评价。结果:建立滇龙胆样品的指纹图谱,并测定出4种主要成分的含量。滇龙胆样品的相对关联度r_i在0.306~0.600,其中14个样品的r_i>0.500,23个样品的r_i<0.400,表明样品质量之间存在较大差异。大理鹤庆的DH3和DH5的r_i分别为0.600和0.576,质量最优。不同地区样品r_i的平均值在0.325~0.541,鹤庆样品r_i的平均值最大,质量总体水平最高,可作为优质种源进一步研究和推广。各地区样品r_i的RSD在4.4%~11.9%,昆明寻甸样品r_i的RSD最小,样品最为稳定。结论:GRA法结合多指标成分定量的评价方法简单、全面,可用于滇龙胆的质量评价,为资源开发利用及优质种源的筛选提供了参考依据。
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滇西北野生滇龙胆根部HPLC指纹图谱研究
《时珍国医国药 》 2017 北大核心 CSCD
摘要：目的建立滇西北少数民族聚居地区野生滇龙胆根部的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱,为其质量评价提供依据。方法采用HPLC法,色谱柱为Agilent Intersil-C18(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B),梯度洗脱,柱温30℃,流速1 ml·min-1,检测波长241 nm,进样量5μl。建立10批滇龙胆根部指纹图谱,采用"中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)"确定共有峰,计算共有峰相对保留时间和相对峰面积,进行相似度分析,并采用SPSS22.0软件进行聚类分析。结果滇龙胆根部指纹图谱共确定17个共有峰,图谱相似度大于0.9,10批样品聚为两类,发现各批次样品成分类型基本一致,成分含量存在差异。检测出5种主要成分马钱苷酸、獐芽菜苷、龙胆苦苷、当药苷和异牡荆苷的含量,各批次样品龙胆苦苷含量均大于3.0%。结论该方法稳定、可靠,可为滇西北滇龙胆药材质量评价及少数民族聚居地区药用植物资源开发提供依据。
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傅里叶变换红外光谱(FTIR)技术对滇龙胆组织培养的研究
《植物科学学报 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：野生药用植物资源的不断减少,使得寻找其原植物的合适替代品显得尤为重要。利用组培材料代替野生药用植物作为药源已取得重大进展,但利用傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)技术筛选合适的组培材料作为野生药用植物替代资源方面的应用鲜有报道。本研究采用FTIR结合偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)对滇龙胆组织培养形成的愈伤组织(肉质部、茎、叶)、增殖苗(肉质部、茎、叶)、生根苗(根、茎、叶)进行比较。结果显示:(1)从原始FTIR光谱图上看,滇龙胆肉质部和根部峰形相似,茎和叶峰形相似;(2)二阶导数光谱图扩大了样品间的差异。在龙胆苦苷的主要吸收峰1612 cm-1附近,吸收峰强度依次为:生根苗叶>增殖苗叶和生根苗茎>增殖苗茎>愈伤组织叶,愈伤组织茎及肉质部、增殖苗肉质部和生根苗根部在该处无吸收峰;(3)PLS-DA得分图表明,同一组培阶段相同组织部位样品聚集在一起,而愈伤组织、增殖苗、生根苗及其各组织部位能够较好的分开。其中:肉质部、根部与茎叶之间距离较远,表明其化学成分和含量可能差异较大;肉质部和根部样品间距离较近,茎和叶样品间距离也较近。二阶导数光谱图显示,组培材料有望代替其原植物满足药用需求;若以龙胆苦苷含量为评价对象,生根苗叶则可能具有更大的开发潜能,有望代替野生滇龙胆以缓解其资源稀缺局面。本研究结果表明,采用傅里叶变换红外光谱法可以简便有效地对药用植物不同组培阶段不同组织部位的替代潜力及开发利用进行初步评估。
关键词： 傅里叶变换红外光谱 药用植物 组织培养 偏最小二乘判别分析 滇龙胆
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