科研产出
云南家蚕核型多角体病毒分离株的毒力测定及系统进化分析
《昆虫学报 》 2018 北大核心 CSCD
摘要：【目的】由家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)侵染家蚕Bombyx mori导致的核型多角体病(血液型脓病)在云南蚕区普遍发生,危害严重,给云南蚕业带来严重的经济损失。本研究旨在测定云南不同蚕区BmNPV分离株的毒力及了解BmNPV在云南的病害流行趋势,为监测和控制云南家蚕血液型脓病打下基础。【方法】通过BmNPV对家蚕5龄幼虫致死率和对家蚕BmN细胞毒力的测定评价了云南蚕区19个BmNPV分离株的致病力;对19个云南BmNPV分离株的bro-d基因进行克隆、测序及系统进化分析。【结果】BmNPV对家蚕5龄幼虫的致死率测定表明,云南不同地区BmNPV毒株对家蚕的口服感染力差异较大;细胞毒力测定结果显示不同BmNPV分离株的出芽型病毒粒子(budded virus, BV)滴度差异较大。进化分析表明,所获取来自云南的19个BmNPV分离株主要分为两个亚群,亚群I在云南省的东部、中部和西部地区均有分布,而亚群II主要集中分布于云南省北部地区。从地理分布图可以看出,亚群I所在地区多为亚热带,温度偏高;而亚群II所处的云南北部地区多为典型高原季风气候,温度相对偏低。【结论】云南蚕区存在丰富的BmNPV株系,各分离株对家蚕的毒力差异较大;云南BmNPV分离株的进化关系在一定程度上与地理气候密切相关。
关键词： 家蚕 蚕区 BmNPV 生物测定 bro-d 云南
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桑粉虱种特异性引物筛选
《西南农业学报 》 2017 北大核心 CSCD
摘要：【目的】桑粉虱Pealius mori(Takahashi)与其他种类粉虱形态相似,识别困难。设计、筛选桑粉虱种特异性引物,为桑粉虱检测和鉴定提供理论依据。【方法】DNAMAN软件比较与桑粉虱同源性较高的国内外具有代表性的7种粉虱线粒体COⅠ基因序列,应用Primer 5.0软件设计5对桑粉虱COⅠ基因特异性引物。将各对引物与不同种类粉虱成虫基因组DNA模板进行PCR扩增,检测目的条带,筛选桑粉虱种的特异性引物。以桑粉虱的卵和幼虫基因组DNA为模板,验证所筛选出的桑粉虱种特异性引物的灵敏性。【结果】2对桑粉虱种特异性引物sfs1-1/sfs1-2、sfs5-1/sfs5-2对桑粉虱单头成虫基因组DNA的PCR扩增产物分别为450、300 bp,而对烟粉虱B型、温室白粉虱无扩增效果。2对引物对桑粉虱DNA模板浓度最低检测值分别为0.15 pg/μl、0.15 ng/μl。引物sfs1-1/sfs1-2灵敏性较引物sfs5-1/sfs5-2高1000倍。2对引物对桑粉虱成虫、幼虫及卵粒的线粒体COⅠ基因皆具较好扩增能力。【结论】引物sfs1-1/sfs1-2、sfs5-1/sfs5具桑粉虱种的特异性,引物sfs1-1/sfs1-2为桑粉虱检测、鉴定的首选引物。
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家蚕抗质型多角体病毒(BmCPV)的研究进展
《蚕业科学 》 2017 北大核心 CSCD
摘要：由家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedosis virus,Bm CPV)感染引发的家蚕中肠型脓病对蚕业生产的危害严重,目前对该病害的防治仍局限于消毒预防。国内外学者希望从筛选的对Bm CPV有较强抵抗力的家蚕品种中寻找抗性基因和分析抗性机制,并通过转基因技术过量表达抗性基因或经RNA干扰病毒侵染增殖关键基因等策略来提高家蚕防御Bm CPV侵染的能力。本文综述家蚕抗Bm CPV研究在上述方面取得的重要进展,并对家蚕抗Bm CPV的分子机制进行分析与讨论,为该领域展开更深入的研究提供较为系统的参考信息。
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家蚕微孢子虫感染对家蚕BmN细胞凋亡以及凋亡蛋白抑制因子IAPs表达的影响
《微生物学报 》 2017 北大核心 CSCD
摘要：【目的】在无任何外界凋亡因素诱导条件下,探究家蚕微孢子虫感染对家蚕卵巢细胞-BmN凋亡的影响,以及凋亡蛋白抑制因子IAPs实相表达的变化情况。【方法】显微镜下观察家蚕微孢子虫感染BmN细胞后不同时间段宿主细胞的变化情况,以及利用荧光定量PCR方法检测家蚕促凋亡基因——细胞色素C(BmCyt c)表达水平的变化,随后检索家蚕基因组与蛋白质家族数据库搜寻家蚕凋亡蛋白抑制因子IAPs基因信息,并通过荧光定量PCR方法对这些基因的实相表达情况进行定量分析。【结果】家蚕微孢子虫感染BmN细胞的前5 d,细胞状态未见明显变化。感染后7 d,BmN细胞的生长受到了一定程度的影响。第12天时,对照组中几乎所有细胞出现空泡化或细胞死亡的现象,而感染家蚕微孢子虫的BmN细胞未见空泡的出现,并且大量细胞形态完整,细胞核清晰可见。同时,BmCyt c基因的表达几乎一直处于被抑制状态,特别是感染后的第10天与第12天,该基因的表达量显著性降低(P<0.01)。通过数据库检索共得到4个家蚕凋亡蛋白抑制因子:BmIAP-1、BmIAP-2、BmSurvivin-1与BmSurvivin-2。荧光定量PCR结果表明:BmIAP-1和BmSurvivin-1基因在感染后期(10 d与12 d)表达量有上升趋势,尤其是感染后的12 d,表达量显著上升(P<0.01)。然而,BmIAP-2与BmSurvivin-2基因的表达在大多数时间段均处于下调状态。【结论】当无任何外界凋亡因素诱导条件下,家蚕微孢子虫感染BmN细胞后可影响宿主细胞的生长,并可抑制细胞的正常生理凋亡。依据荧光定量PCR结果,我们推测在家蚕微孢子虫感染BmN细胞时,BmIAP-1和BmSurvivin-1蛋白可能在调节细胞凋亡的过程中起一定作用。
关键词： 家蚕卵巢细胞 家蚕微孢子虫 细胞凋亡 家蚕凋亡蛋白抑制因子 荧光定量PCR
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云南蚕区家蚕品种资源对家蚕核型多角体病毒的抗性评价分析
《南方农业学报 》 2017 北大核心 CSCD
摘要：【目的】全面掌握云南蚕区家蚕品种资源的抗家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)能力,为挖掘具有特色的家蚕抗病材料及培育适应当地的抗病品种提供参考。【方法】采用三龄起蚕经口添食相同浓度病毒、逐日调查存活率的方法,对200个家蚕品种(品系)进行Bm NPV抗性评价和筛选;并通过接种后每日存活数、各发育时期存活率等指标分析云南蚕区家蚕品种资源对Bm NPV的抗性水平、发病死亡规律、不同抗性品种的发病死亡时期及同一品种不同品系间抗性差异。【结果】云南蚕区家蚕品种资源中抗Bm NPV的品种有731、795、854B、872A、966B、B黄肉色茧、P50、山河B、选二甲白和竹印,感病品种包括955、242A、242B、963B、DW3、锦秀A、锦秀B、日、野乙和云夏A油。各抗病品种和感病品种首次出现死亡差异的时间截点分别是接种后96和48 h,二者相差48 h;部分抗病品种在秋季对Bm NPV的抗性水平低于春季;同一家蚕品种A系和B系的抗病性差异不显著(P>0.05)。【结论】云南蚕区家蚕品种资源中大多数品种的抗Bm NPV能力属于中等水平,其中P50为Bm NPV抗性最强品种。对未知品种进行抗Bm NPV测定时,可选择接种后168 h作为抗性评价的时间截点。
关键词： 家蚕品种 核型多角体病毒(BmNPV) 抗性评价 云南蚕区
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家蚕丝氨酸蛋白酶基因BmSP25转录分析及其免疫响应
《南方农业学报 》 2017 北大核心 CSCD
摘要：【目的】分析家蚕丝氨酸蛋白酶(SP)基因序列BmSP25及转录情况,明确其表达规律对防御家蚕核型多角体病毒(BmNPV)入侵的免疫应答机制,为揭示BmSPs在家蚕免疫应答方面的功能作用提供理论依据。【方法】克隆BmSP25基因序列,对该基因编码蛋白的氨基酸序列、分子量、结构域等进行生物信息学分析;利用Gene Doc和MEGA5.0对BmSP25氨基酸序列进行多序列比对及系统发育进化树分析,采用半定量RT-PCR对家蚕不同组织和发育时期的BmSP25基因转录情况进行分析,并以实时荧光定量PCR检测BmSP25基因在BmNPV感染家蚕中肠组织中的转录水平。【结果】BmSP25基因的ORF全长885 bp,编码294个氨基酸,其中第1~17位氨基酸为信号肽,去信号肽的分子量为29.1 kD,理论等电点为7.8。BmSP25蛋白由4个α螺旋、15个β折叠和一些无规则卷曲构成;其氨基酸序列同源性比对分析发现,BmSP25(BGIBMGA008514-PA)与蓓带夜蛾SP序列(Gen Bank登录号ADM35105)的同源性最高,为62.1%。BmSP25基因在家蚕中肠组织中特异表达,且在整个幼虫时期呈持续性表达。BmSP25基因在家蚕感染BmNPV后发生明显变化,至感染6 h时呈下调趋势,而在感染3、12和24 h时均呈明显上调表达。【结论】BmSP25在防御BmNPV入侵家蚕的免疫应答过程中发挥重要作用。鉴于昆虫SP具有高度保守的底物特异性位点,因此可利用底物类似物、基因定点突变等方式来预防农林害虫。
关键词： 家蚕 丝氨酸蛋白酶(SP)基因 表达 BmNPV感染 转录分析
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家蚕微孢子虫海藻糖合成酶基因Nbtps1的克隆与原核表达
《蚕业科学 》 2017 北大核心 CSCD
摘要：海藻糖在保护细胞质膜和生物大分子空间结构,维持胞内渗透压增大的过程中发挥重要作用,海藻糖合成酶是海藻糖合成途径中的一个关键酶。通过检索微孢子虫基因组数据库发现,家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)基因组中含有4个海藻糖合成酶基因,其中Nbtps1基因的开放阅读框长1 386 bp,为单外显子结构,编码461个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量53.7 k D,等电点5.19。Nb TPS1蛋白序列含有1个糖基转移酶结构域和4个潜在的N-糖基化位点,亚细胞定位预测该蛋白质位于细胞质中。多重序列比对分析结果表明,Nb TPS1与东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)、兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)海藻糖合成酶的氨基酸序列相似度分别为59.0%、54.7%,系统发育进化树显示三者的亲缘关系与之相符。构建重组表达载体Nbtps1/p ET-28a(+)并转化大肠埃希菌Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导表达及亲和纯化后获得最终质量浓度为1.18 mg/m L的重组融合蛋白His-Nb TPS1。用纯化后的融合蛋白制备兔多克隆抗体Anti-Nb TPS1,利用间接ELISA法测定多克隆抗体的效价达1∶25 600,并通过Western blotting检测验证了该多克隆抗体的特异性,为研究Nb TPS1的生物学功能以及家蚕微孢子虫的间接免疫检测奠定了实验基础。
关键词： 家蚕微孢子虫 海藻糖合成酶 基因克隆 序列分析 原核表达 多克隆抗体
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短时热激后家蚕对核型多角体病毒的抗性及相关抗菌肽和热激蛋白基因表达水平的变化
《昆虫学报 》 2017 北大核心 CSCD
摘要：【目的】探讨短时热激对家蚕Bombyx mori抵抗核型多角体病毒能力的影响,为深入研究家蚕热激响应的抗病毒免疫机制提供参考。【方法】家蚕5龄幼虫42℃热激15 min后,经口喂食家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)(5.4×106PIBs/头)后正常饲养,观察热激对家蚕感染病毒的影响;同时,利用实时荧光定量RT-PCR技术检测热激后7类抗菌肽主基因(Bmcec D,Bmmor,Bmglve2,Bmdefe B,Bmatta1,Bmenbo2和Bmlebo3)以及6种热激蛋白基因(Bmhsp90,Bmhsp70,Bmhsp40,Bmhsp19.9,Bmhsp21.4和Bmhsp25.4)在家蚕5龄幼虫中肠组织中的表达变化;利用MEGA 5.0软件对家蚕所有热激蛋白进行系统进化分析。【结果】与未进行热激处理相比,短时42℃热激能够明显提高感染Bm NPV的家蚕5龄幼虫的存活率。实时荧光定量RT-PCR结果表明,与未热激处理相比,热激处理后感染Bm NPV的家蚕5龄幼虫中肠组织中Bmglve2和Bmhsp25.4的表达量显著上升。另外,系统进化分析显示,小分子热激蛋白Bm HSP25.4在进化上特殊,单独与大分子热激蛋白(Bm HSP90,Bm HSP70和Bm HSP40)聚为一类。【结论】短时热激能够提高家蚕对Bm NPV的抗性,热激蛋白基因Bmhsp25.4和抗菌肽基因Bmglve2可能在家蚕热激响应的抗病毒免疫中发挥关联功能。
关键词： 家蚕 热激 BmNPV 抗菌肽 热激蛋白 mRNA表达水平
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家蚕核型多角体病毒(BmNPV)T3株对家蚕的亚致死作用测试
《蚕业科学 》 2017 北大核心 CSCD
摘要：病毒对宿主昆虫的亚致死作用是指感染病毒后未死亡的昆虫,其生长发育、生殖等生命活动能力发生了明显变化。为了探明生产上发生家蚕血液型脓病时是否存在病原物家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)对家蚕的亚致死作用,以家蚕品种菁松×皓月的蚁蚕为材料,测试以低于致死中浓度(LC_(50))的Bm NPV-T3多角体悬液添食处理对存活家蚕的亚致死作用。测定Bm NPV-T3对蚁蚕的LC_(50)值为1.41×10~5m L~(-1)。以浓度为10~5~10~3m L~(-1)的Bm NPV-T3多角体悬液给蚁蚕添食后,存活幼虫的体质量显著降低;10~5m L~(-1)多角体悬液添毒试验组存活幼虫的发育历期明显延长,而对蛹期发育历期的影响不显著;10~5m L~(-1)和10~4m L~(-1)多角体悬液添毒试验组的存活幼虫发育至成虫,其产卵量显著低于对照组;10~5m L~(-1)多角体悬液添毒试验组存活幼虫的蛹体质量、全茧量、茧层量、茧层率均受到一定影响,其中对雌蚕的茧层量影响显著。依据上述试验结果初步认为,以低于致死中浓度的Bm NPV悬液给蚁蚕添毒后,对蚕体的生长发育和产茧、产卵性状都具有一定的影响,Bm NPV对家蚕存在亚致死作用。
关键词： 家蚕核型多角体病毒 亚致死 家蚕 生长 生殖 产茧量
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采自云南省的一种野生绢丝昆虫的分子鉴定与茧质性状调查
《蚕业科学 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：云南省是我国大蚕蛾科(Saturniidae)绢丝昆虫资源最为丰富的地区之一。利用DNA条形码技术对采自云南省楚雄地区的一种野生绢丝昆虫进行分子鉴定,并调查其茧质性状。提取该野生绢丝昆虫的蛹基因组DNA,以昆虫线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因(mt DNA COⅠ)片段通用引物PCR扩增,获得一段长度为574 bp的mt DNA COⅠ基因片段(Gen Bank登录号:KR812471)。基于mt DNA COⅠ基因序列比对,该野生绢丝昆虫与柞蚕属(Antheraea)的明目大蚕蛾(A.frithi)同源序列的相似度为99.47%。应用Kimura-2-Parameter模型计算该野生绢丝昆虫与2种明目大蚕蛾及其他19种柞蚕属绢丝昆虫的遗传距离,结果显示其与明目大蚕蛾的遗传距离仅为0.005;构建的进化树中,该野生绢丝昆虫也是最先与明目大蚕蛾聚在一起。此外,该野生绢丝昆虫的成虫形态特征与已有文献描述明目大蚕蛾的特征相符。综合分子鉴定结果与成虫的形态特征,确认该野生绢丝昆虫为明目大蚕蛾(Antheraea frithi)。供试明目大蚕蛾所生产的茧为黄褐色,有茧柄,无茧孔,平均茧大小为20 mm×38 mm,平均单粒茧质量6.55 g,平均茧层率10.8%,初步认为具有潜在的开发利用价值。
关键词： 野生绢丝昆虫 大蚕蛾科 明目大蚕蛾 线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因 蚕茧性状
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