科研产出
滇龙胆GrCMS基因的克隆与表达分析
《植物研究 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶是赤藓糖磷酸酯(MEP)途径中的第三个催化酶。以滇龙胆转录组为基础,采用RT-PCR技术从滇龙胆幼叶克隆2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶基因GrCMS,并进行原核表达和组织特异性表达分析。序列分析显示,GrCMS基因(登录号KJ917164)开放阅读框(ORF)长933 bp,编码310氨基酸,推测分子量为34.23 kD,等电点为7.68。蛋白质序列分析显示,GrCMS无信号肽,为亲水稳定蛋白,主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,可能定位叶绿体;具有CMS保守结构域。进化分析结果表明,GrCMS蛋白与长春花CrCMS蛋白亲缘关系最近。原核表达结果表明,GrCMS与预期蛋白大小一致。定量PCR结果表明,GrCMS基因主要在叶中表达。结果为进一步研究该基因功能和龙胆苦苷生物合成途径奠定基础。
关键词： 滇龙胆 2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶 基因克隆 表达分析
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家蚕核型多角体病毒对家蚕酚氧化酶活性及其基因表达的影响
《中国农学通报 》 2016
摘要：为明确家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染对家蚕血淋巴酚氧化酶活性及其基因表达的影响,以5龄起蚕为实验材料,经口添食BmNPV,采用实时荧光定量PCR的方法检测了血淋巴酚氧化酶原基因PPO1和PPO2的表达情况,同时测定了酚氧化酶的活性。结果表明,PPO1和PPO2基因均是在添食BmNPV后6 h和9 h出现上调表达,但相对表达量有一定差异;另外,酚氧化酶活性在添食BmNPV后6 h和9 h显著高于对照组,而在24 h急剧下降,显著低于对照组。酚氧化酶作为一类体液免疫因子,很可能参与了家蚕对抗BmNPV侵染的免疫防御反应。
关键词： 家蚕核型多角体病毒 血淋巴 酚氧化酶活性 基因表达
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滇龙胆乙酰CoA转移酶基因的克隆与表达分析
《江苏农业科学 》 2016 北大核心
摘要：根据滇龙胆转录组乙酰CoA酰基转移酶基因GrAACT序列设计引物,使用逆转录PCR(RT-PCR)技术从滇龙胆幼叶扩增该基因,并进行序列分析、原核表达和组织特异性分析。结果表明:GrAACT基因(登录号KJ917163)开放阅读框长1 215 bp,编码404个氨基酸;GrAACT蛋白相对分子质量41.41 ku,p I值为6.25,属于AACT蛋白家族成员,无信号肽,为疏水稳定蛋白,主要由α-螺旋、无规则卷曲构成;GrAACT蛋白具有AACT蛋白保守结构域:硫解酶N端结构域(第12~272位氨基酸)、硫解酶C端结构域(第282~402位氨基酸)、类硫解酶结构域(第13~403位氨基酸);在硫解酶C端结构域中,包含硫解酶保守位点(第350~366位氨基酸)、硫解酶活性位点(第385~398位氨基酸);滇龙胆GrAACT蛋白与长春花CrAACT蛋白亲缘关系最近;GrAACT基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为67.41 ku;组织特异性表达分析结果表明,GrAACT基因主要在茎、根中表达。
关键词： 滇龙胆 乙酰CoA酰基转移酶 基因克隆 生物信息学分析 表达分析
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不同钾水平下花魔芋差异表达基因分析
《中国蔬菜 》 2016 北大核心
摘要：为了探索魔芋对不同水平钾素营养的反应机制,提取施用低、中、高水平硫酸钾5d后的富源花魔芋叶片总RNA,合成了c DNA,采用优化的c DNA-SRAP技术体系分析了在低钾、中钾、高钾水平下富源花魔芋叶片的差异表达基因,并对其进行了生物信息学分析。结果显示:29对引物组合共扩增出507条基因片段,其中差异片段126条。相对于中钾处理,低钾、高钾处理的差异片段包括抑制型表达片段19条,诱导型表达片段14条,上调表达型片段29条,下调表达型片段64条。选取表达量高的13条差异片段进行回收测序,并在NCBI上进行BLAST比对,共比对出9条差异片段的同源序列,其中4条与已知功能基因(谷氨酰胺酰-t RNA合成酶、β-ATP合成酶、GTP结合蛋白、核苷酸还原酶)有较高同源性,5条与假定基因或预测基因同源性较高,剩余序列未找到同源序列,可能是一些新的魔芋与钾营养吸收利用相关的基因,具体功能还有待于进一步研究。
关键词： 富源花魔芋 c DNA-SRAP 基因表达 钾水平
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番茄环纹斑点病毒非结构蛋白NSs的原核表达及多抗血清制备
《西南农业学报 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：用RT-PCR从感染番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,TZSV)的番茄中扩增出编码病毒非结构蛋白NSs基因,将NSs基因构建到原核表达载体p ET-30 a中,获得原核表达载体p ET-30a-NSs,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDSPAGE电泳分析显示,高效诱导表达了57k Da融合蛋白。用回收纯化的融合蛋白免疫家兔,获得多抗血清。间接ELISA测定多抗血清的效价为1/8192。用制备好的抗血清对TZSV感病病样进行Western blotting检测,能检测到特异性条带。结果表明该抗血清可用于TZSV的检测,并为进一步研究NSs功能奠定了基础。
关键词： 番茄环纹斑点病毒 非结构蛋白 原核表达 抗血清 检测
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花青素合成途径关键酶基因在彩色马铃薯块茎中的表达分析
《西南农业学报 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：根据植物花青素合成途径关键酶基因序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术,在转录水平上检测这些基因在彩色马铃薯不同颜色块茎中的表达情况。从18个基因中筛选到类黄酮3’5’-羟化酶基因、二氢黄酮醇还原酶基因、类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因、类黄酮5-O-葡萄糖基转移酶基因、甲基转移酶基因、谷胱甘肽转移酶基因、调节基因AN2和AN1等8个基因在不同颜色薯肉中表达有差异,说明这些基因的表达可能与块茎肉色相关。研究检测的基因中有8个在马铃薯中未见报道,本研究根据矮牵牛的基因序列,寻找马铃薯的同源序列,经检测这些同源序列在彩色马铃薯块茎中都有表达产物,表明这些同源序列可能是目的基因,研究结果为今后在马铃薯上分离克隆花青素合成途径关键酶基因奠定基础。
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滇龙胆甲羟戊酸激酶基因的克隆与表达分析
《生命科学研究 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：甲羟戊酸激酶是甲羟戊酸途径的关键酶。根据滇龙胆转录组甲羟戊酸激酶基因Gr MK序列,设计一对基因特异性引物克隆该基因,并进行序列分析;构建原核表达载体p GEX-4T-1-Gr MK,转入大肠杆菌Rosetta(DE3),重组蛋白在37℃、1.0 mmol/L IPTG诱导下成功表达。生物信息学分析结果表明,Gr MK蛋白为甲羟戊酸激酶家族成员,具有MK蛋白保守结构域:乳糖激酶/高丝氨酸激酶/甲羟戊酸激酶/磷酸甲羟戊酸激酶(GHMP kinase)N端结构域、C端结构域和ATP结合结构域;Gr MK与长春花Cr MK亲缘关系最近.原核表达结果表明,融合蛋白相对分子质量与推断大小一致。组织特异性表达分析结果表明Gr MK基因主要在根中表达.这些结果为Gr MK蛋白结构和功能的研究奠定基础。
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黄草乌Av-F3'5'H基因的克隆与表达分析
《西南农业学报 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：根据已发表的川乌头F3'5'H基因序列,通过RT-PCR方法从黄草乌(Aconitum vilmorinianum)花朵中克隆到了1个类黄酮3',5'羟基化酶(F3’5’H)基因的c DNA序列,该序列长1563 bp,包含1个编码506个氨基酸的完整开放阅读框,命名为Av-F3'5'H(Gen Bank登录号:JQ806761)。序列比对分析显示Av-F3'5'H蛋白与其它物种的F3'5'H蛋白序列有很高的序列相似性,包含有已确定的CYP基序、I螺旋区和血红素结合区等保守基序等。以川乌头18sRNA基因(FJ748878)为内参,通过RT-PCR对Av-F3'5'H基因的时空表达模式进行了分析,结果显示Av-F3'5'H基因的表达水平随花朵发育进程而呈递增趋势,在第3时期的花朵中达到最高,随后又逐渐降低,而在根、茎和叶中均不表达,推测该基因可能在调节黄草乌花朵蓝色形成过程中起重要作用。
关键词： 黄草乌 类黄酮-3',5'-羟基化酶 克隆 表达
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滇龙胆甲羟戊酸二磷酸脱羧酶基因的克隆与表达分析
《贵州农业科学 》 2015 北大核心
摘要：为获得滇龙胆GrMDC基因序列,以滇龙胆转录组为基础,采用RT-PCR技术从滇龙胆幼叶克隆GrMDC基因,并进行原核表达和组织特异性表达分析。结果表明:滇龙胆GrMDC基因(登录号KJ917169)全长1 275bp,GrMDC蛋白相对分子量为46.77kD,pI为5.97;该蛋白可能定位于细胞质,无信号肽,为亲水不稳定蛋白,主要由α-螺旋和无规则卷曲构成;GrMDC蛋白与长春花CrMDC蛋白相似性较高(88.12%),且亲缘关系最近;GrMDC基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为72.77kD(含GST标签26kD),与预期蛋白大小一致;GrMDC基因主要在根中表达。
关键词： 滇龙胆 甲羟戊酸二磷酸脱羧酶 基因克隆 原核表达 组织特异性表达
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桑树类黄酮3–O–葡萄糖基转移酶基因的鉴定及主效基因功能分析
《园艺学报 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：根据同源比对,从川桑(Morus notabilis)基因组数据库(morus.swu.edu.cn/morusdb/)中鉴定类黄酮3–O–葡萄糖基转移酶基因(MaUFGT)家族成员。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析MaUFGT在桑树各组织和发育期的表达水平。随着果实发育成熟,MaUFGT1、MaUFGT2和MaUFGT3的表达模式相似,均呈上升趋势;在从顶芽依次向下不同叶位中,3个UFGT基因表达呈现先降低后升高,再降低又升高的趋势;在幼茎皮层和托叶中大量表达,幼茎表皮和木质部、叶柄中表达量较低,有的甚至不表达。MaUFGT2的表达量在3个基因中都是最高的,推测其是该基因家族的主效基因。从桑树品种‘嘉陵40’成熟果实中克隆了UFGT2基因,命名为MaUFGT2,登录号KP455729.1。其c DNA全长为1 386 bp,编码461个氨基酸,推测蛋白质分子量约为51 k D。序列比对结果发现所编码蛋白在不同物种间保守性不高。将MaUFGT2克隆到p ET-28a(+)原核表达载体后在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析显示,融合蛋白大小约为55 k D,主要以包涵体形式表达,在上清液中也有少量表达。MaUFGT2蛋白经纯化和复性后,最后通过高效液相色谱(HPLC)分析该蛋白的酶活性,结果表明,体外酶活性鉴定MaUFGT2能够催化UDP葡萄糖转移至槲皮素形成槲皮素3–β–D–葡萄糖苷,验证了其具有糖基转移酶的功能。
关键词： 桑树 果实 类黄酮3–O–葡萄糖基转移酶 UFGT基因 表达 酶活性分析
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