科研产出
黄草乌Av-F3'5'H基因的克隆与表达分析
《西南农业学报 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：根据已发表的川乌头F3'5'H基因序列,通过RT-PCR方法从黄草乌(Aconitum vilmorinianum)花朵中克隆到了1个类黄酮3',5'羟基化酶(F3’5’H)基因的c DNA序列,该序列长1563 bp,包含1个编码506个氨基酸的完整开放阅读框,命名为Av-F3'5'H(Gen Bank登录号:JQ806761)。序列比对分析显示Av-F3'5'H蛋白与其它物种的F3'5'H蛋白序列有很高的序列相似性,包含有已确定的CYP基序、I螺旋区和血红素结合区等保守基序等。以川乌头18sRNA基因(FJ748878)为内参,通过RT-PCR对Av-F3'5'H基因的时空表达模式进行了分析,结果显示Av-F3'5'H基因的表达水平随花朵发育进程而呈递增趋势,在第3时期的花朵中达到最高,随后又逐渐降低,而在根、茎和叶中均不表达,推测该基因可能在调节黄草乌花朵蓝色形成过程中起重要作用。
关键词： 黄草乌 类黄酮-3',5'-羟基化酶 克隆 表达
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桑树类黄酮3–O–葡萄糖基转移酶基因的鉴定及主效基因功能分析
《园艺学报 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：根据同源比对,从川桑(Morus notabilis)基因组数据库(morus.swu.edu.cn/morusdb/)中鉴定类黄酮3–O–葡萄糖基转移酶基因(MaUFGT)家族成员。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析MaUFGT在桑树各组织和发育期的表达水平。随着果实发育成熟,MaUFGT1、MaUFGT2和MaUFGT3的表达模式相似,均呈上升趋势;在从顶芽依次向下不同叶位中,3个UFGT基因表达呈现先降低后升高,再降低又升高的趋势;在幼茎皮层和托叶中大量表达,幼茎表皮和木质部、叶柄中表达量较低,有的甚至不表达。MaUFGT2的表达量在3个基因中都是最高的,推测其是该基因家族的主效基因。从桑树品种‘嘉陵40’成熟果实中克隆了UFGT2基因,命名为MaUFGT2,登录号KP455729.1。其c DNA全长为1 386 bp,编码461个氨基酸,推测蛋白质分子量约为51 k D。序列比对结果发现所编码蛋白在不同物种间保守性不高。将MaUFGT2克隆到p ET-28a(+)原核表达载体后在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析显示,融合蛋白大小约为55 k D,主要以包涵体形式表达,在上清液中也有少量表达。MaUFGT2蛋白经纯化和复性后,最后通过高效液相色谱(HPLC)分析该蛋白的酶活性,结果表明,体外酶活性鉴定MaUFGT2能够催化UDP葡萄糖转移至槲皮素形成槲皮素3–β–D–葡萄糖苷,验证了其具有糖基转移酶的功能。
关键词： 桑树 果实 类黄酮3–O–葡萄糖基转移酶 UFGT基因 表达 酶活性分析
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喂食家蚕核型多角体病毒诱导家蚕抗菌肽基因表达
《南方农业学报 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：【目的】阐明家蚕抗菌肽基因对病毒感染的中肠免疫应答模式,为揭示昆虫抗病毒机制提供参考。【方法】采用喂食家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)给家蚕的方式进行诱导,以实时荧光定量PCR检测诱导后家蚕抗菌肽基因的表达情况,并比较Bm NPV诱导下8类已知家蚕抗菌肽主基因(cecropin D、moricin、gloverin2、defension B、attacin1、enbocin2、lysozyme和lebocin3)在肠道组织中表达水平的差异。【结果】在喂食Bm NPV处理3 h时,家蚕中肠组织中呈上调表达的抗菌肽基因仅有moricin基因;处理6 h时,cecropin D、gloverin2、moricin基因转录水平均呈明显的上调趋势,尤其以gloverin2基因的诱导活性相对最高,是对照组gloverin2基因的9.22倍;而在处理12和24 h时检测,发现8类已知家蚕抗菌肽基因表达量均小于1.0,呈下调趋势。【结论】Bm NPV侵染家蚕后gloverin2基因表达量明显上调,可能是gloverin2基因作为主要功能基因在病毒侵染早期过程中发挥了重要作用。
关键词： 家蚕核型多角体病毒(BmNPV) 抗菌肽基因 诱导 表达
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蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12基因的克隆分析与原核表达
《中国病原生物学杂志 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：目的克隆并表达蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12。方法根据家蚕微孢子虫基因组数据库信息设计简并引物进行PCR扩增,克隆得到蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12基因。利用生物信息学软件对NpSWP12的基因与蛋白序列进行分析与结构功能预测。将该蛋白基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,转化表达载体至大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE与Western blot检测。结果蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12基因长687bp,编码228个氨基酸残基(基因登录号:KT287071),预测蛋白质分子质量单位为26.6ku,等电点(pI)为5.96。蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12基因结构为单外显子结构,编码的蛋白中α螺旋占77.19%。该编码蛋白含有1个BAR结构域(Bin/Aphiphysin/Rvs domain),属BAR结构域蛋白质超家族成员。NpSWP12与家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbSWP12核苷酸序列序列相似性为95.2%,氨基酸序列相似性为96.9%。表达载体NpSWP12/pET-30a(+)转入BL21(DE3)菌株,IPTG诱导,得到的重组蛋白rNpSWP12与理论蛋白分子质量大小(30ku)相符。Western blot鉴定。结论成功克隆了蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12基因,构建的NpSWP12/pET-30a(+)重组原核表达载体表达预期分子质量的融合蛋白,该蛋白能被相应抗体识别,为进一步研究NpSWP12的细胞定位和功能奠定了基础。
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滇龙胆1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因GrDXR的克隆、序列分析与原核表达
《中草药 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：目的从滇龙胆Gentiana rigescens幼叶中克隆萜类合成关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因GrDXR,进行序列分析和原核表达。方法根据滇龙胆转录组中GrDXR基因序列,设计引物,通过RT-PCR扩增得到GrDXR开放阅读框(ORF)序列,并进行TA克隆、测序和序列分析;构建原核表达载体pGEX-4T-1-GrDXR,转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,在IPTG诱导下进行表达。结果 GrDXR ORF全长1 425 bp,编码474个氨基酸。序列分析表明,GrDXR基因是DXR家族成员;蛋白质序列系统发育分析表明,GrDXR与萝芙木RvDXR、橡胶树HbDXR和长春花CrDXR亲缘关系较近。构建pGEX-4T-1-GrDXR重组质粒,获得稳定的原核表达体系。SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。结论克隆了GrDXR基因,建立其稳定的原核表达体系,为进一步纯化GrDXR蛋白,研究其结构和功能奠定基础。
关键词： 滇龙胆 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因 基因克隆 序列分析 原核表达
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滇龙胆GrGPPS基因的克隆及其序列分析与原核表达
《中草药 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：目的从滇龙胆Gentiana rigescens幼叶中克隆单萜化合物合成的关键酶牻牛儿基焦磷酸合成酶基因GrGPPS,进行序列特征分析和原核表达。方法根据三年生滇龙胆转录组GrGPPS基因序列,设计特异性引物,通过RT-PCR扩增得到GrGPPS cDNA序列,并进行TA克隆、测序及序列分析;构建原核表达载体pGEX-4T-1-GrGPPS,转入Escherichia coli Rosetta(DE3)中,在37℃、1.0 mmol/L IPTG诱导下进行表达。结果 GrGPPS cDNA全长1 107 bp,编码369个氨基酸;序列分析表明,GrGPPS基因是异戊烯基合成酶家族的成员;氨基酸序列系统发育分析表明,GrGPPS与金鱼草AmGPPS亲缘关系最近;构建pGEX-4T-1-GrGPPS重组质粒,获得稳定的pGEX-4T-1-GrGPPS原核表达体系。SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。结论克隆了GrGPPS基因,建立pGEX-4T-1-GrGPPS稳定的原核表达体系,为进一步纯化和鉴定GPPS蛋白并研究其结构和功能奠定基础。
关键词： 滇龙胆 牻牛儿基焦磷酸合成酶基因 基因克隆 序列分析 原核表达
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滇龙胆GrSLS1基因的克隆与原核表达
《西北植物学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：以滇龙胆转录组为基础,采用RT-PCR技术克隆了滇龙胆幼叶裂环番木鳖苷合酶基因,命名为GrSLS1(GenBank登录号KF941191)。序列分析结果显示,GrSLS1基因开放阅读框长1 560bp,编码519个氨基酸;GrSLS1蛋白相对分子量为59.33kD,pI为8.96。生物信息学分析结果表明,GrSLS1蛋白属于SLS家族成员,其N端含有一跨膜螺旋区域(10~32);二级结构分析结果表明,GrSLS1蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲组成;系统发育分析表明,GrSLS1与帽柱木MsSLS2蛋白亲缘关系最近。构建原核表达载体pGEX-4T-GrSLS1,对GrSLS1基因进行原核表达,SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。该研究为进一步研究GrSLS1基因功能及通过在龙胆中过表达该基因提高龙胆苦苷含量奠定基础。
关键词： 滇龙胆 GrSLS1基因 基因克隆 序列分析 原核表达
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滇龙胆GrCYP450-17基因的克隆、序列分析与原核表达
《中草药 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：目的从滇龙胆幼叶中克隆萜类合成相关酶基因GrCYP450-17,进行序列分析和原核表达。方法根据滇龙胆转录组中GrCYP450-17基因序列,设计引物,通过RT-PCR扩增得到GrCYP450-17开放阅读框(ORF)序列,并进行TA克隆、测序和序列分析;构建原核表达载体pGEX-4T-1-GrCYP450-17,转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下进行表达。结果 GrCYP450-17 ORF全长1 545 bp,编码514个氨基酸。序列分析表明,GrCYP450-17基因是CYP714家族成员;蛋白质序列系统发育分析表明,GrCYP450-17与番茄SlCYP450亲缘关系最近。构建pGEX-4T-1-GrCYP450-17重组质粒,获得稳定的原核表达体系。SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。结论克隆了GrCYP450-17基因,建立其稳定的原核表达体系,为进一步纯化GrCYP450-17蛋白、研究其结构和功能奠定基础。
关键词： 滇龙胆 GrCYP450-17 基因克隆 序列分析 原核表达
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烟草花叶病毒原核表达外壳蛋白抗体制备及快速检测方法建立
《西南农业学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：用RT-PCR从感染烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的烟草样品中克隆该病毒的外壳蛋白基因,病毒外壳蛋白基因再亚克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,构建成重组原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导、Ni+NTA亲和柱纯化获重组蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔,制备TMV外壳蛋白多克隆抗体,并用制备的多克隆抗体建立了更简便、经济、特异性更强的DOT-ELISA检测法。
关键词： 烟草花叶病毒 原核表达 多克隆抗体 DOT-ELISA
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