科研产出
非洲菊GjMnSOD基因的克隆及表达分析
《生物技术通报 》 2021 北大核心 CSCD
摘要：以非洲菊品种‘玲珑’为材料,利用RT-PCR技术克隆获得一条CDS长为519 bp的SOD基因（GenBank ID:MH708534.1）。利用生物信息学手段分析了该基因及其编码蛋白的序列特征,并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术分析了该基因在3种激素（100 μmol/L IAA、SA和GA3）和3种非生物胁迫（200 mmol/L NaCl盐胁迫、30% PEG模拟干旱和4℃低温处理）下的表达模式。结果显示:该基因可编码分子量为19 203.85、等电点（pI）为7.93、无信号肽及跨膜结构的稳定亲水蛋白。该蛋白含有典型Sod-Fe-C保守结构域,在141-148位氨基酸之间含有一个MnSOD特征序列（DVWEHAYY）,因此命名为GjMnSOD。Wolf Psort预测结果显示GjMnSOD定位于线粒体。GjMnSOD与刺苞菜蓟MnSOD相似性最高（为93.86%）且在进化上亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示:GjMnSOD的表达受IAA、GA3、SA、盐胁迫和低温显著抑制;在干旱胁迫下,GjMnSOD的表达呈"先降后升"的表达趋势,于处理4 h后显著高于对照。研究结果表明GjMnSOD参与非洲菊对多种逆境胁迫的响应,尤其在非洲菊应答干旱胁迫过程中发挥重要作用。
关键词： 非洲菊 锰超氧化物歧化酶 基因克隆 表达分析 逆境胁迫响应
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参与辣椒素合成的DnaJ基因家族全表达谱分析
《辣椒杂志 》 2020
摘要：背景:DnaJ蛋白在植物发育和胁迫反应中发挥重要作用.近年来,通过对辣椒基因组全面的生信分析鉴定到76个DnaJ基因.但目前尚无辣椒DnaJ基因系统发育关系和表达谱的研究报道.因此,我们对不同组织、非生物胁迫和激素响应下辣椒DnaJ基因的系统发育关系和表达谱进行了系统的分析.结果:系统发育分析显示,辣椒DnaJ基因按序列同源性可分为7个亚族(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ亚族).辣椒DnaJ基因在不同组织中的表达显示,38%(29/76)的辣椒DnaJ基因在至少一个组织中表达.结果表明,DnaJ基因在辣椒生长发育中具有潜在的关键作用.另外,为了解辛辣和非辛辣辣椒DnaJ基因在胎座中的表达差异,我们还利用RNA-Seq数据和qRT-PCR分析了辣椒DnaJ基因的表达模式.通过比较分析发现,8个基因在辛辣辣椒和非辛辣辣椒中的表达差异显著.CaDnaJs与胎座发育过程中参与辣椒素合成的基因共同表达.更重要的是,我们的研究揭示了这8个DnaJ基因可能受到胁迫(热、干旱和盐)的调控,同时也受到植物激素的调控(ABA,GA3,MeJA和SA).结论:综上所述,部分在胎座中表达的DnaJ基因可能参与了植物在与刺激性相关化合物生物合成过程中对非生物胁迫的响应.本研究为辣椒DanJ基因的表达谱提供了广泛的认识,有助于我们对辣椒中的DnaJ基因功能认识.
关键词： DnaJ蛋白 辣椒 表达分析 系统发育 非生物胁迫
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桑树几丁质酶基因Machi1的克隆及原核表达
《蚕业科学 》 2019 北大核心 CSCD
摘要：以桑品种云桑2号的健康叶片为材料,通过反转录PCR结合RACE方法克隆到桑树几丁质酶基因Machi1(GenBank登录号:MK783295).Machi1基因的完整ORF序列长度为972 bp,编码323个氨基酸残基,预测Machi1蛋白分子质量为349kD,理论等电点(pI)为684.结构分析显示Machi1蛋白含有一个信号肽,无跨膜结构域.Machi1蛋白属于糖苷水解酶19家族,含有保守的ChtBD1结构域,预测具有几丁质酶活性.多序列比对结果表明,Machi1蛋白与川桑几丁质酶Mnchi19一致性最高为935%,系统进化树结果与之相一致.组织表达模式分析结果表明,Machi1基因在桑树叶片中的表达量最高.随后通过原核表达系统获得了重组目的蛋白并进行了纯化,用纯化的蛋白质免疫新西兰大白兔制备Anti-Machi1多克隆抗体.利用间接ELISA法测定其效价在1∶80 000以上,并经Western blotting验证了该多克隆抗体的特异性,为后续研究Machi1的抗病机制及生物学功能奠定了基础.
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猪雄性增强抗原1基因MEA1编码区克隆、表达及生物信息学分析
《云南农业大学学报(自然科学) 》 2018 北大核心 CSCD
摘要：【目的】克隆猪MEA1基因编码区序列,获得基因表达谱并了解其蛋白质的基本功能。【方法】从GenBank下载猪及近缘物种MEA1序列作为参考序列,设计特异引物从版纳微型猪近交系(BMI)睾丸组织中扩增MEA1基因完全编码序列及部分侧翼序列,对MEA1翻译的蛋白质序列进行多种功能生物信息学分析并构建多物种系统进化树,最后用实时荧光定量PCR技术检测BMI 15个重要组织的MEA1 mRNA转录表达水平。【结果】扩增得到BMI MEA1编码区序列长525 bp,编码174个氨基酸。功能生物信息学分析表明:MEA1含有1个完整的保守结构域,无跨膜螺旋结构,无N端信号肽序列,二级结构以无规卷曲为主,N末端疏水,C末端均亲水,有3类功能活性位点。系统进化分析表明:MEA1基因在进化中高度保守,且与人、长臂猿的亲缘关系最近,符合物种的系统分类地位。多组织相对荧光定量表达分析表明:MEA1基因在睾丸中高表达,在心、肝等其他14个组织中低表达。【结论】为探索BMI MEA1基因在睾丸形成和精子发生过程中的作用及功能奠定基础。
关键词： 雄性增强抗原 版纳微型猪近交系 组织表达 生物信息学
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温度对临沧铁壳麦种子生活力、发芽期α-淀粉酶活性及其基因表达的影响
《麦类作物学报 》 2018 北大核心 CSCD
摘要：为研究临沧铁壳麦种子在发芽期的α-淀粉酶活性及其编码基因相对表达量与种子贮藏温度、贮藏时间及生活力间的关系,分别采用3,5-二硝基水杨酸法和实时定量PCR法测量α-淀粉酶活性及其编码基因的相对表达量。结果表明,与低温贮藏种子相比,高温贮藏种子的发芽期α-淀粉酶活性和amy1基因的相对表达量均显著升高;amy3基因的相对表达量则显著下降,与α-淀粉酶活性呈极显著正相关;二者与生活力指标(如发芽速率、发芽指数、发芽势、发芽率和活力指数等)呈显著或极显著正相关;而低温贮藏种子的发芽期α-淀粉酶活性与amy3基因的相对表达量呈显著或极显著负相关。说明贮藏温度尤其是高温不仅强烈影响种子发芽期α-淀粉酶活性及其基因相对表达量,而且可明显改变二者与生活力指标间的相关性。
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甘蔗MOC1基因(ScMOC1)的克隆与表达分析
《植物遗传资源学报 》 2017 北大核心 CSCD
摘要：MONOCULM 1(MOC1)基因在植物腋分生组织和腋芽的形成中发挥重要作用,是植物分蘖关键调控基因。本研究利用同源基因克隆法结合RT-PCR、RACE技术从甘蔗品种ROC22中克隆获得MOC1的同源基因,命名为Sc MOC1。生物信息学分析发现该基因的c DNA序列包含一个长度为1299 bp的开放阅读框,编码432个氨基酸残基组成的含有GRAS保守结构域的非分泌蛋白,其分子量为45.43 k D,理化等电点p I为6.98。序列比对分析显示Sc MOC1与高粱(Sorghum bicolor(L.)Moench)、赖草(Leymus secalinus(Georgi)Tzvel.)、水稻(Oryza sativa L.)等禾本科植物同源蛋白氨基酸序列一致性较高;系统进化树分析显示其与高粱、小米草(Setaria italica(L.)P.Beauv.)、玉米(Zea mays L.)等禾本科植物MOC1同源蛋白亲缘关系最近;Sc MOC1在甘蔗品种ROC22中的序列变异分析发现,30个克隆得到的序列中共有46个SNP位点和29处In Del位点,其中1个位点发生的单个碱基缺失和另一个位点的4个碱基插入是造成基因编码蛋白序列变化的主要原因。中性检测表明,Sc MOC1在ROC22中遵循中性进化模型。采用实时荧光定量PCR分析Sc MOC1在甘蔗品种ROC22分蘖期不同组织部位(根、茎、叶、分蘖芽、叶鞘、生长点)、茎尖生长点和不同发育阶段腋芽(幼嫩腋芽、半大腋芽、较大腋芽、成熟休眠腋芽)的表达特征,结果显示Sc MOC1在分蘖期的ROC22中的表达具有组织特异性,在生命活跃的茎尖生长点处表达量最高;在腋芽形成发育过程中该基因表达总体呈现出"升-降-升-降"的趋势,说明Sc MOC1基因可能在甘蔗腋芽形成发育阶段中发挥作用。以上研究可推测Sc MOC1在甘蔗的分蘖性状调控上扮演重要的角色。本研究为Sc MOC1的功能研究及其在甘蔗产量分子辅助育种中的利用奠定基础。
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滇龙胆香叶醇10-羟化酶基因的克隆与表达分析
《西南农业学报 》 2017 北大核心 CSCD
摘要：【目的】克隆滇龙胆香叶醇10-羟化酶基因Gr G10H(geraniol 10-hydroxylase),分析其生物信息学特征、基因结构、蛋白表达和组织表达情况,为龙胆苦苷生物合成途径解析提供理论依据。【方法】通过RT-PCR及基因克隆方法,从滇龙胆总RNA中克隆得到基因Gr G10H及其基因组序列;使用生物信息学方法分析其DNA序列及其编码蛋白特性,使用Clustal X2.1软件对Gr G10H蛋白质及其同源序列做序列比对,使用MEGA7.0软件进行系统发育树构建;利用定量PCR技术分析Gr G10H基因在滇龙胆根茎叶中的表达水平。【结果】使用RT-PCR方法从滇龙胆叶片中克隆得Gr G10H基因全长为1834 bp,包含2外显子和1内含子,ORF1548 bp,将序列提交至Gen Bank,得到序列号KJ418410。生物信息学分析表明,该基因编码515个氨基酸,分子量为57.74 k D,理论等电点为9.02;该蛋白属于细胞色素P450超家族成员,定位于内质网,其N端含一跨膜螺旋(21~43),其中1~20氨基酸残基位于膜内,44~515位于膜外。该蛋白无信号肽,为亲水稳定蛋白,主要由无规则卷曲(44.85%)和α-螺旋(40.58%)构成。Gr G10H蛋白与川西獐牙菜Sm G10H蛋白具有较高的相似性(87%),且亲缘关系最近。原核表达结果表明,Gr G10H基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为83.74 k D(含GST标签26.00 k D),与预期蛋白大小一致。组织特异性表达分析结果表明Gr G10H基因主要在叶中表达。【结论】克隆到滇龙胆Gr G10H基因,并成功在大肠杆菌中表达,推测其在主要叶片中起作用。
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大肠杆菌植酸酶appA基因的克隆、表达及性质分析
《江西农业学报 》 2017
摘要：通过维生素C-钼蓝法,从饲喂青饲料的猪的粪便中分离筛选出1株产较高活性appA植酸酶的大肠杆菌菌株;采用PCR方法从该菌株的基因组中克隆获得植酸酶appA基因,测序结果显示PCR产物全长1447 bp,该植酸酶基因编码区有1296个核苷酸,编码432个氨基酸。将该编码区克隆至pPIC9K载体,并转化入巴斯德毕赤酵母进行甲醇诱导表达,获得了约55 k Da的特征条带,表达96 h后其上清液的酶活力达到368 U/m L。经Ni亲和柱纯化后进行部分酶学性质分析,结果表明:重组appA植酸酶的最适反应温度为55℃,温度高于60℃后其酶活下降明显;其最适pH值为5.0。
关键词： 植酸酶 appA基因 大肠杆菌 克隆 表达 毕赤酵母
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外源乙烯利与1-MCP处理对桑椹中乙烯和花青素相关代谢基因表达的影响
《林业科学 》 2017 北大核心 CSCD
摘要：【目的】以桑品种‘嘉陵40号’的桑椹为试验材料,探究乙烯在桑椹发育进程中的作用和乙烯相关基因的表达模式,为今后有效开发桑椹的经济价值和通过分子生物学手段调控桑椹成熟期提供理论依据。【方法】桑盛花期后21天(21DAF)和26天(26DAF),分别用100 mg·L~(-1)乙烯利喷洒桑椹表面,采摘后桑椹经0.5μL·L~(-1)乙烯抑制剂1-MCP熏蒸处理,测定其花青素和总糖含量,并提取桑椹的总RNA及合成cDNA模板,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析乙烯生物合成基因MaACO2和MaACS3,乙烯信号转导基因MaETR1,MaETR2,MaCTR1,MaEIN2和MaEIL2,以及花青素生物合成下游基因MaDFR和MaANS的转录表达。【结果】桑椹经过乙烯利处理后,花青素含量和总糖含量与对照相比都有明显增加,与花青素合成有关的基因表达也受乙烯利上调,经1-MCP熏蒸的桑椹花青素含量和总糖含量与对照相比都有所下降。在21DAF桑椹中,乙烯相关基因的表达经乙烯利处理后显著上调,而对1-MCP具有不同的响应模式,其中,MaACO2,MaACS3以及MaEIL2表达下调,MaETR1,MaCTR1和MaEIN2的表达量在各时段显著上调,MaETR2表达量在12 h无明显变化,其他时段上调。26DAF桑椹中,经1-MCP的熏蒸而下调了乙烯各基因的表达,而乙烯利的处理对各基因表达具有不同的影响,与对照相比,处理后32 h,MaACO2,MaETR1,MaETR2,MaEIN2和MaEIL2的表达上调,MaACS3和MaCTR1的表达则下调。【结论】乙烯利处理能够诱导桑椹乙烯生物合成和花青素生物合成相关基因的上调表达,对乙烯信号转导基因也有一定调控作用,且能促进桑椹花青素和总糖含量的积累,并能加快桑椹的发育进程。乙烯抑制剂1-MCP的熏蒸能抑制乙烯信号转导各元件基因的表达,阻止乙烯信号转导和传递,且抑制桑椹中花青素和总糖含量的积累。
关键词： 桑 乙烯利 1-MCP 花青素 基因表达 信号转导
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甘蔗TAD1(ScTAD1)的克隆与表达分析
《中国农业科学 》 2017 北大核心 CSCD
摘要：【目的】Tillering and Dwarf 1(TAD1)是植物株型发育的重要调控基因,该基因与腋芽的形成发育密切相关。获得甘蔗TAD1(ScTAD1)并预测其结构和功能,分析其在甘蔗不同组织部位、不同发育阶段腋芽中及在用生长素(IAA)和细胞分裂素(6-BA)处理后的蔗苗非伸长茎梢部的表达情况,以期为ScTAD1的功能分析及其在甘蔗产量分子辅助育种中的利用奠定理论基础。【方法】采用电子克隆技术并结合反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR),c DNA末端快速扩增(rapid-amplification of c DNA ends,RACE)等技术获得ScTAD1的c DNA全长,然后利用生物信息学方法对其序列结构、功能、同源性进行分析;再使用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,q PCR)技术对该基因在甘蔗品种ROC22不同组织部位(根、茎、叶、分蘖芽、叶鞘、生长点)、茎尖生长点和不同发育阶段腋芽(幼嫩腋芽、半大腋芽、较大腋芽、成熟休眠腋芽)及叶片分别喷施IAA和6-BA不同时间点幼苗非伸长茎梢部的表达特征进行分析。【结果】获得ScTAD1的c DNA全长(Gen Bank登录号为KX611166),序列分析发现其包含1个1 560 bp的完整开放阅读框,编码519个氨基酸残基,其编码蛋白分子量为55.57 k D,理论等电点p I为9.16。保守结构域分析表明ScTAD1包含7个WD40重复序列的保守结构域;信号肽预测结果表明ScTAD1蛋白不存在信号肽,为非分泌蛋白;三级结构预测表明ScTAD1与二穗短柄草(XP_003558934.1)、玉米(XP_008650376.1)和水稻(AAN74839.1)相关同源蛋白三级结构高度相似,且与高粱假定蛋白(XP_002468612.1)亲缘关系最近。q PCR分析结果表明ScTAD1在甘蔗根、茎、叶、分蘖芽、叶鞘、生长点等不同组织部位均有表达,其中在分蘖芽中的表达量最高,其次为叶和叶鞘,根中表达较弱;不同发育阶段甘蔗腋芽中,ScTAD1在幼嫩腋芽中表达最高;叶片喷施植物激素IAA和6-BA 36 h后该基因表达开始升高,但喷施6-BA 48 h后表达又回落到未处理水平,表明这两类激素对ScTAD1表达有调控作用。【结论】成功从ROC22中获得ScTAD1的c DNA序列,该基因在甘蔗不同组织部位均有表达,其中分蘖芽中表达量最高;推测ScTAD1可能在甘蔗腋芽形成发育早期发挥作用,其表达水平受生长素和细胞分裂素调控。
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